Resumos

Periodontia

Avaliação da resposta imune celular em pacientes com periodontite^* * Parte da Dissertação de Mestrado. ** Professora do Departamento de Odontologia da UEM-Maringá. *** Professores dos Departamentos de Ciências Patológicas e de Medicina Oral e Odontologia Infantil da UEL-Londrina. **** Aluna do Curso de Odontologia da UEL-Londrina. † Professor do Departamento de Microbiologia da Universidade de São Paulo - São Paulo.

Evaluation of the cellular immune response in patients with periodontitis

Mirian Marubayashi HIDALGO^** * Parte da Dissertação de Mestrado. ** Professora do Departamento de Odontologia da UEM-Maringá. *** Professores dos Departamentos de Ciências Patológicas e de Medicina Oral e Odontologia Infantil da UEL-Londrina. **** Aluna do Curso de Odontologia da UEL-Londrina. † Professor do Departamento de Microbiologia da Universidade de São Paulo - São Paulo.

Eiko Nakagawa ITANO^*** * Parte da Dissertação de Mestrado. ** Professora do Departamento de Odontologia da UEM-Maringá. *** Professores dos Departamentos de Ciências Patológicas e de Medicina Oral e Odontologia Infantil da UEL-Londrina. **** Aluna do Curso de Odontologia da UEL-Londrina. † Professor do Departamento de Microbiologia da Universidade de São Paulo - São Paulo.

Cristina Sayuri NISHIMURA^**** * Parte da Dissertação de Mestrado. ** Professora do Departamento de Odontologia da UEM-Maringá. *** Professores dos Departamentos de Ciências Patológicas e de Medicina Oral e Odontologia Infantil da UEL-Londrina. **** Aluna do Curso de Odontologia da UEL-Londrina. † Professor do Departamento de Microbiologia da Universidade de São Paulo - São Paulo.

Wilson TREVISAN JUNIOR^*** * Parte da Dissertação de Mestrado. ** Professora do Departamento de Odontologia da UEM-Maringá. *** Professores dos Departamentos de Ciências Patológicas e de Medicina Oral e Odontologia Infantil da UEL-Londrina. **** Aluna do Curso de Odontologia da UEL-Londrina. † Professor do Departamento de Microbiologia da Universidade de São Paulo - São Paulo.

Mario Julio AVILA-CAMPOS^†

HIDALGO, M. M.; ITANO, E. N.; NISHIMURA, C. S.; TREVISAN JUNIOR, W.; AVILA-CAMPOS, M. J. Avaliação da resposta imune celular em pacientes com periodontite. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 12, n. 2, p. 121-127, abr./jun. 1998.

A resposta linfoproliferativa a Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) e ao mitógeno fitohemaglutinina (PHA) foi avaliada comparativamente em grupos de pacientes com Periodontite de Incidência Precoce (PIP), Periodontite de Adulto (PA) e controles saudáveis sem doença periodontal. Como antígenos foram utilizados a mistura de extratos sonicados de cinco isolados provenientes de pacientes com PIP, confirmados como Aa, e os extratos sonicados de Aa de referência ATCC 29522, ATCC 29523 e FDC Y4. Os resultados da resposta linfoproliferativa a Aa não demonstraram diferenças estatisticamente significantes em pacientes com PIP (n = 9) ou PA (n = 20) em relação ao grupo controle (n = 20). Utilizando os extratos sonicados de Aa previamente aquecidos ou não, foi detectada a presença de fator ou fatores termolábeis com capacidade de suprimir a resposta linfoproliferativa específica, indicando a necessidade do aquecimento do extrato para a real avaliação da resposta linfoproliferativa. Frente ao mitógeno PHA, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos, sugerindo a não indução do estado de imunossupressão em pacientes com periodontites. Experimentos subseqüentes com extratos aquecidos ou não demonstraram a presença de fator ou fatores termoestáveis com capacidade de suprimir a resposta a PHA, diferenciando-se da resposta específica. A presença desses fatores, que serão caracterizados posteriormente, poderia explicar a não detecção de alteração na resposta imune celular nos pacientes com periodontite.

UNITERMOS: Imunidade celular; Transformação linfocítica; Periodontite.

INTRODUÇÃO

As diversas formas de doença periodontal podem ser convenientemente divididas em dois grandes grupos segundo a idade em que incidem: Periodontite de Incidência Precoce (PIP) e Periodontite de Adulto (PA). A PIP é uma forma de periodontite que progride rapidamente, porém, a destruição tecidual encontrada não é compatível com a tenra idade do paciente e a quantidade de placa presente¹⁶. Envolve a Periodontite Pré-Puberal e a Periodontite Juvenil quando afetada a dentição decídua ou a permanente, respectivamente. A PA, por sua vez, caracteriza-se por uma inflamação crônica dos tecidos periodontais nos indivíduos adultos, podendo atingir diversos estágios até a migração e a exfoliação do dente⁴.

O papel desempenhado pelas bactérias da placa dental supra e subgengival no desenvolvimento das doenças periodontais está amplamente documentado na literatura^6,13. A PIP tem sido freqüentemente associada a Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), que é o principal habitante das bolsas periodontais desses pacientes¹², enquanto que, na PA, o Aa encontra-se associado a outros microrganismos¹³.

Por outro lado, a resposta imune do hospedeiro apresenta um importante papel na patogênese de diversas doenças periodontais, uma vez que pode estar inibida ou alterada em função do agente patogênico e de seus fatores de virulência⁶. Pouco se sabe sobre a resposta imune celular nas infecções associadas com Aa. Alguns autores relataram deficiências na imunidade celular que incluiria um defeito linfocitário seletivo, com uma conseqüente diminuição da transformação linfoblástica frente a mitógenos ou estímulos antigênicos nos pacientes com Periodontite Juvenil Localizada (PJL) e PA⁸, enquanto outros autores evidenciaram um aumento da transformação linfocitária frente a estimulação com placa dental autóloga, mitógenos e antígenos bacterianos em pacientes com PJL^5,7. Já outros trabalhos indicaram não encontrar diferenças na resposta linfoproliferativa frente a mitógenos e extratos bacterianos^14-16,19.

No Brasil, GOMEZ et al.² (1993) avaliaram a atividade blastogênica em células mononucleares de pacientes portadores de PA sob estimulação com fitohemaglutinina (PHA) e demonstraram uma diminuição quando comparada a de controles saudáveis.

Considerando os dados não congruentes na literatura e a inexistência de dados brasileiros sobre a resposta imune celular específica dos pacientes com PIP, este trabalho propôs-se a avaliar comparativamente a resposta linfoproliferativa a Aa e ao mitógeno PHA em grupos de pacientes com periodontite e controles saudáveis.

MATERIAL E MÉTODOS

Casuística

Pacientes da Clínica de Periodontia do Departamento de Medicina Oral e Odontologia Infantil da UEL foram selecionados por um especialista com base nos dados obtidos após anamnese e exame clínico e radiográfico. Todos os pacientes portadores de PIP (n = 9, idades entre 7 e 30 anos, sendo a média de 19,7) apresentavam evidências clínicas e radiográficas de perda óssea alveolar localizada nos primeiros molares e incisivos decíduos ou permanentes com envolvimento de, no máximo, 14 dentes. Pacientes com mais de 35 anos de idade, exibindo periodontite crônica e sem história prévia de doença periodontal na juventude foram considerados como PA (n = 20, idades entre 35 e 56 anos, sendo a média de 41,2). Indivíduos sadios, sem evidência clínica ou radiográfica de doença periodontal, foram escolhidos como controles, com idade e sexo semelhantes à população estudada (n = 20). Ninguém havia estado em tratamento com antibióticos durante os 3 meses anteriores à coleta de material.

Obtenção do extrato de A. actinomycetemcomitans

Após remoção da placa supragengival, dois finos cones de papel absorvente esterilizados foram introduzidos na bolsa periodontal do dente mais afetado dos pacientes com PIP e dispersos em salina tampão fosfato (PBS) 0,15 M e pH 7,2, através da utilização de agitador Vortex¹. Amostras diluídas (fator 10 até 10^-3) foram plaqueadas em meio seletivo ágar de soja tripticaseína-soro de cavalo-bacitracina-vancomicina (TSBV, Difco Laboratories, USA) para isolamento de Aa¹⁰. As placas inoculadas foram incubadas em condições de anaerobiose (jarras Difco Laboratories, USA, com catalisador e gerador de CO₂ Gas-Pak, BBL, USA), para isolamento primário a 37ºC durante 72 horas. Foi realizada, então, a identificação presuntiva baseada nas características coloniais, celulares e bioquímicas típicas da espécie¹¹. As amostras de Aa isoladas foram cultivadas em ágar sangue e caldo infuso cérebro-coração (BHI, Difco Laboratories, USA), ambos suplementados com 0,5% de extrato de levedura, em condições de microaerofilia (método da vela), sendo confirmada a pureza da amostra através da coloração de Gram. Após lavagens com PBS, a massa celular obtida foi sonicada (15 ciclos/50 volts/minuto, com intervalo de 2 minutos) em aparelho fabricado na própria Universidade (UEL - Brasil) e realizada a dosagem de proteínas (Labtest, Brasil) a partir do sobrenadante obtido por centrifugação a 10.000 g (Sorvall Instruments, USA) durante 20 minutos a 4ºC. Em seguida, foram misturados iguais volumes de todos os isolados bacterianos obtidos (n = 5), formando um "pool" de extrato sonicado de Aa. Uma nova dosagem de proteínas totais foi realizada para confirmação, seguida de esterilização por filtração em membrana Millipore de 0,2 mm e estocagem a -20ºC, até seu uso posterior. Da mesma forma, foram obtidos os extratos sonicados de Aa ATCC 29522 (sorotipo b), ATCC 29523 (sorotipo a) e FDC Y4 (sorotipo b).

Obtenção de amostras de soro e células mononucleares

Amostras de soro foram obtidas por centrifugação do sangue periférico após coagulação. Para obtenção de células mononucleares³, o sangue venoso obtido assepticamente em tubos heparinizados foi centrifugado e a interfase entre eritrócitos e plasma foi colhida, diluída em igual volume de PBS e depositada sobre um gradiente descontínuo de Histopaque (Sigma Chemical Co., USA) com densidade 1.076. As células mononucleares lavadas foram ressuspendidas em meio de cultura RPMI 1640 enriquecido (soro bovino fetal 10%, L-glutamina, piruvato de sódio, garamicina e HEPES) e ajustadas a uma concentração final de 10⁶ células/ml.

Ensaio de resposta linfoproliferativa

A suspensão celular de linfócitos (0,1 ml) de cada um dos doadores foi distribuída nos orifícios da placa escavada (96 orifícios, Corning Lab. Sci. Co., USA), adicionando-se em cada um a concentração previamente determinada como ideal de 12,5 mg/ml dos diferentes extratos sonicados de Aa (ATCC 29522, ATCC 29523, FDC Y4 e "pool") ou 5 mg/ml de PHA (Laboratório de Genética-USP, Ribeirão Preto, Brasil), como estímulo para os linfócitos. A cultura foi realizada em triplicata em um mesmo volume final e em todos os experimentos; foram utilizados como controle negativo linfócitos sem Aa ou PHA. As placas de cultura foram incubadas a 37ºC durante 120 horas (Aa) e 72 horas (PHA), com 5% de CO₂. Oito horas antes de se esgotar o tempo de incubação, foram adicionados 3,5 ml de timidina tritiada diluída 1/20 (1 mCi). As células foram coletadas semi-automaticamente em papel de filtro Filtermat. Cada papel foi recortado e colocado em frasco contendo 2,5 ml de líquido de cintilação (Fundação Sardi, Brasil) e contado em aparelho cintilador Beckmann LS 6.800. Os resultados individuais de cada doador foram expressos em índice de proliferação, obtidos pela utilização da seguinte fórmula:

ÍNDICE DE PROLIFERAÇÃO = média de leitura em contagem por minuto (cpm) das triplicatas da resposta linfoproliferativa ao antígeno ou mitógeno/média de leitura em cpm das triplicatas da resposta linfoproliferativa na ausência de estímulo.

Adicionalmente, foram realizadas culturas de linfócitos com os diferentes extratos sonicados de Aa previamente aquecidos durante 30 minutos a 56ºC ou não, de forma isolada ou concomitante com PHA.

Análise estatística

Todos os dados experimentais foram analisados tanto pela análise de variância como pelo teste t-Student.

RESULTADOS

Resposta linfoproliferativa a extratos sonicados de Aa

Encontrou-se um perfil semelhante de resposta linfoproliferativa em todos os grupos estudados, não sendo observada nenhuma diferença estatisticamente significante (Gráfico 1). São dignos de menção a existência de amplo desvio padrão nas respostas dos pacientes, em especial dos com PIP, e o baixo índice de proliferação obtido. Comparando extrato aquecido e não aquecido, verificou-se um aumento importante no índice de proliferação dos linfócitos quando estimulados com extratos aquecidos (Gráfico 2). No entanto, apenas se encontrou diferença estatisticamente significante (p < 0,05) nas respostas linfoproliferativas aos antígenos de Aa ATCC 29522 e 29523.

Resposta linfoproliferativa ao mitógeno PHA

Não se encontrou diferença estatisticamente significante entre o índice de proliferação dos grupos PIP, PA e controle (Gráfico 3). Quando comparadas às respostas linfoproliferativas a PHA e PHA + extrato sonicado de Aa previamente aquecido ou não, observou-se uma redução, sendo estatisticamente significante (p < 0,05) com as cepas de referência (Gráfico 4). Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre as respostas dos linfócitos estimulados com PHA e PHA + "pool" de Aa e entre as respostas aos estímulos dos diferentes extratos aquecidos ou não.

DISCUSSÃO

A resposta imune celular específica ao Aa pode ser avaliada por meio de resposta linfoproliferativa in vitro, e este estudo demonstrou um perfil semelhante dessa resposta nos grupos de PIP, PA e controle, sendo obtido um baixo índice de proliferação, mesmo no grupo de controles sadios. Esses resultados são concordantes com STASHENKO et al.¹⁴ (1985), SUZUKI et al.¹⁵ (1984), TAKAHASHI et al.¹⁶ (1995) e YOSHIDA-MINAMI et al.¹⁹ (1995). Outros autores^5,7 encontraram um aumento na resposta linfoproliferativa, sendo que TEW et al.¹⁷ (1981) relataram que os pacientes com periodontites tendem a responder mais aos extratos bacterianos, embora sem diferença estatisticamente significante. Neste estudo, foi detectada essa tendência e os resultados apresentaram um amplo desvio padrão, fato que poderia refletir as variações individuais existentes, pois alguns pacientes apresentaram respostas mais intensas do que a de outros.

Apesar de os antígenos homólogos apresentarem resultados mais evidentes que os antígenos heterólogos na avaliação da resposta imune, dada a dificuldade operacional em se trabalhar com diferentes isolados, no presente trabalho foi preparado um "pool" dos isolados obtidos. Além disso, considerando a possibilidade de prevalência de um dado sorotipo de Aa na população, foram utilizadas cepas de referência (sorotipos a e b), não se encontrando, porém, diferenças significativas entre elas.

Avaliou-se também a modulação da resposta linfoproliferativa ao Aa por fatores séricos do hospedeiro, mas nenhuma diferença foi encontrada, sugerindo a inexistência, nesses soros, de fator solúvel do microrganismo ou de alteração nas moléculas regulatórias do sistema imune com capacidade de interferir na resposta linfoproliferativa (dados não apresentados).

Dado o baixo índice de proliferação encontrado frente aos antígenos solúveis de Aa, antígenos esses que poderiam conter leucotoxinas capazes de destruir as células mononucleares em cultura ou conter fatores supressores, foram realizados ensaios com extratos sonicados de Aa pré-aquecidos, observando-se aumento significativo no índice de linfoproliferação. Embora a leucotoxina e o fator imunossupressor de linfócitos, ambos descritos como fatores de virulência de Aa, sejam termolábeis, os resultados obtidos sugerem a atuação de algum fator (ou fatores) imunossupressor (es) independentes da leucotoxina, uma vez que, com a cepa não leucotóxica de Aa ATCC 29523¹², foi observado efeito supressor. Esse fator ou fatores termolábeis detectados nos isolados utilizados poderiam ser fator ou fatores já citados na literatura como toxinas, componentes da parede celular ou enzimas bacterianas⁹.

Em vista disso, a inexistência de diferenças na resposta linfoproliferativa ao Aa nos grupos PIP, PA e controle tanto poderia ser devida à não indução de resposta imune celular específica, como ao fator ou fatores supressivos presentes nos extratos. O mesmo pode ter ocorrido em outros trabalhos citados na literatura^14,15,16,19. Assim, para o estudo da resposta celular ao Aa, é necessária a utilização de antígeno previamente aquecido. Coletivamente, esses dados indicam a importância da bactéria e/ou de produtos bacterianos como agentes imunorregulatórios exógenos que poderiam ter profundos efeitos no hospedeiro, influenciando o curso da infecção.

Uma regulação das células T ou função linfocitária anormal poderia contribuir para a progressão da doença infecciosa, incluindo a doença periodontal. Assim, neste trabalho, foi analisada também a resposta linfoproliferativa a PHA, não sendo encontradas diferenças significativas entre os grupos estudados, o que vem de encontro com as observações de que os pacientes com PIP não apresentavam sinais ou sintomas de susceptibilidade a outras infecções ou doenças sistêmicas. Entretanto, nota-se que a distribuição dos valores individuais dos índices de proliferação frente a PHA é ligeiramente diferente quando comparada a dos pacientes com PA e controles saudáveis, o que, segundo STASHENKO et al.¹⁴ (1985), poderia ser explicado pela existência de um subgrupo desses pacientes apresentando linfócitos T com função diminuída e conseqüente resposta proliferativa deficiente. Maior número de pacientes com PIP seria necessário para melhor analisar a distribuição de valores individuais.

SHENKER et al.⁹ (1982) observaram que o extrato sonicado solúvel de Aa inibe a resposta dos linfócitos frente a mitógenos, provavelmente interferindo em sua ligação aos receptores da superfície celular, uma necessidade bem estabelecida para a ativação dos linfócitos¹⁸. Os resultados também demonstraram a participação de fator ou fatores supressores presentes em extratos de Aa com capacidade para suprimir a resposta linfoproliferativa a PHA. Essa supressão possivelmente se deve a fator ou fatores termoestáveis, uma vez que tanto extratos de Aa aquecidos como não aquecidos apresentaram a mesma atividade.

A dificuldade encontrada na análise e interpretação dos resultados obtidos foi a mesma relatada por outros autores^8,15,16 e deve-se aos diferentes parâmetros usados no critério de diagnóstico clínico ou à existência de ampla variação dos valores intragrupos. Alguns pacientes apresentavam resultados semelhantes aos controles e vice-versa, possivelmente devido a reações cruzadas com outros microrganismos ou à resposta imune frente ao Aa não patogênico encontrado em indivíduos com boa saúde bucal. Por outro lado, a presença de Aa patogênico apresentando leucotoxina ou fator supressor em pacientes com PIP poderia interferir na indução da resposta imune específica do hospedeiro, resultando em ausência de resposta imune frente ao antígeno.

Considerando-se os poucos relatos na literatura nacional e internacional, este trabalho representa o estudo inicial em que se avalia o estado imunológico celular em pacientes brasileiros portadores de periodontite. Trabalhos posteriores utilizando maior número de pacientes deverão ser realizados com o intuito de entender melhor a patogênese das doenças periodontais.

CONCLUSÕES

1. Em pacientes portadores de PIP e PA, não foi observada resposta imune celular específica anti-Aa mais intensa do que no grupo controle.

2. Existe (m) no antígeno de Aa fator (es) termolábil (eis) que suprime (m) a resposta linfoproliferativa, sendo necessário o pré-aquecimento do antígeno para a avaliação da resposta imune celular específica.

3. Não foi observada diferença estatisticamente significante na resposta linfoproliferativa a PHA nos grupos estudados, sugerindo a não ocorrência de imunossupressão nos pacientes com PIP ou PA.

4. Os extratos sonicados de Aa contêm fator (es) termoestável (eis) que induz (em) a inibição da resposta linfoproliferativa ao mitógeno PHA.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à técnica Mári Sumigawa Kaminami, pela colaboração inestimável durante todo o desenvolvimento do trabalho. Apoio financeiro: CPG/UEL 303.717/94 e PROUNI/CCS/UEL.

HIDALGO, M. M.; ITANO, E. N.; NISHIMURA, C. S.; TREVISAN JUNIOR, W.; AVILA-CAMPOS, M. J. Evaluation of the cellular immune response in patients with periodontitis. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 12, n. 2, p. 121-127, abr./jun. 1998.

The purpose of this study was to compare the lymphoproliferative response to Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) and to phytohemaglutinin (PHA) mitogen, in groups of patients with early-onset periodontitis (EOP, n = 9), adult periodontitis (AP, n = 20), and healthy controls without periodontal disease (n = 20). As antigens, a mixture of sonicated extracts of five isolates obtained from EOP patients, and sonicated extracts of Aa reference strains ATCC 29522, ATCC 29523, and FDC Y4 were used. No statistically significant difference was observed between the three groups as to the lymphoproliferative response to Aa. The use of previously heated and unheated Aa sonicated extracts demonstrated the existence of heat-labile factor or factors capable of depressing the specific lymphoproliferative response. This indicates the necessity of using a heated extract for a valid evaluation of lymphoproliferative response. As for the lymphoproliferative response to the PHA mitogen, no significant differences between groups were observed. This suggests that there was no induction of immunosuppression in the patients with periodontitis. In addition, in experiments with heated or unheated Aa extracts, the presence of heat-stable factor or factors capable of suppressing the PHA response was noticed. The presence of these factors could explain why no alteration of the cellular immune response was detected in the patients with periodontitis.

UNITERMS: Immunity, cellular; Lymphocyte transformation; Periodontitis.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recebido para publicação em 03/06/97

Aceito para publicação em 20/11/97

Datas de Publicação

Histórico