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ESTUDO ULTRAESTRUTURAL DO COLO UTERINO DE RATAS OOFORECTOMIZADAS APÓS APLICAÇÃO DE ÓLEO DE COPAÍBA¹1 Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. 2 Doutora em Medicina pela UNIFESP – EPM.3 Professor Titular e Livre Docente da Disciplina de Obstetrícia de Tocoginecologia da UNIFESP – EPM.4 Professor Adjunto de Histologia do Departamento de Morfologia da UNIFESP – EPM.5 Pesquisador do Instituto Evandro Chagas de Belém – PA .6 Graduanda em Medicina pela UEPA; Estagiária do LCE/UEPA.

Nara Macedo Botelho Brito²1 Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. 2 Doutora em Medicina pela UNIFESP – EPM.3 Professor Titular e Livre Docente da Disciplina de Obstetrícia de Tocoginecologia da UNIFESP – EPM.4 Professor Adjunto de Histologia do Departamento de Morfologia da UNIFESP – EPM.5 Pesquisador do Instituto Evandro Chagas de Belém – PA .6 Graduanda em Medicina pela UEPA; Estagiária do LCE/UEPA.

Luiz Kulay-Júnior³1 Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. 2 Doutora em Medicina pela UNIFESP – EPM.3 Professor Titular e Livre Docente da Disciplina de Obstetrícia de Tocoginecologia da UNIFESP – EPM.4 Professor Adjunto de Histologia do Departamento de Morfologia da UNIFESP – EPM.5 Pesquisador do Instituto Evandro Chagas de Belém – PA .6 Graduanda em Medicina pela UEPA; Estagiária do LCE/UEPA.

Manuel de Jesus Simões⁴1 Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. 2 Doutora em Medicina pela UNIFESP – EPM.3 Professor Titular e Livre Docente da Disciplina de Obstetrícia de Tocoginecologia da UNIFESP – EPM.4 Professor Adjunto de Histologia do Departamento de Morfologia da UNIFESP – EPM.5 Pesquisador do Instituto Evandro Chagas de Belém – PA .6 Graduanda em Medicina pela UEPA; Estagiária do LCE/UEPA.

Oswaldo Alves Mora⁴1 Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. 2 Doutora em Medicina pela UNIFESP – EPM.3 Professor Titular e Livre Docente da Disciplina de Obstetrícia de Tocoginecologia da UNIFESP – EPM.4 Professor Adjunto de Histologia do Departamento de Morfologia da UNIFESP – EPM.5 Pesquisador do Instituto Evandro Chagas de Belém – PA .6 Graduanda em Medicina pela UEPA; Estagiária do LCE/UEPA.

José Antônio Diniz⁵1 Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. 2 Doutora em Medicina pela UNIFESP – EPM.3 Professor Titular e Livre Docente da Disciplina de Obstetrícia de Tocoginecologia da UNIFESP – EPM.4 Professor Adjunto de Histologia do Departamento de Morfologia da UNIFESP – EPM.5 Pesquisador do Instituto Evandro Chagas de Belém – PA .6 Graduanda em Medicina pela UEPA; Estagiária do LCE/UEPA.

Luciana Garcia Lamarão⁶1 Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental (LCE) da Universidade do Estado do Pará (UEPA) com apoio do Instituto Evandro Chagas e financiamento do FUNTEC/SECTAM – PA; Tese de Doutorado apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. 2 Doutora em Medicina pela UNIFESP – EPM.3 Professor Titular e Livre Docente da Disciplina de Obstetrícia de Tocoginecologia da UNIFESP – EPM.4 Professor Adjunto de Histologia do Departamento de Morfologia da UNIFESP – EPM.5 Pesquisador do Instituto Evandro Chagas de Belém – PA .6 Graduanda em Medicina pela UEPA; Estagiária do LCE/UEPA.

Brito NMB, Kulay-Júnior L, Simões MJ, Diniz JÁ, Lamarão LG. Estudo ultraestrutural do colo uterino de ratas ooforectomizadas após aplicação de óleo de copaíba. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Oct-Dec;15(4). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO: Em virtude da extensa utilização empírica do óleo de copaíba em tratamentos ginecológicos, este trabalho visa realizar um estudo ultraestrutural do colo uterino de ratas após aplicação deste óleo. Foram utilizadas 12 ratas adultas distribuídas em 4 grupos: Água, Milho, Padrão e Copaíba. Os animais foram submetidos a ooforectomia bilateral e após 21 dias foi iniciada a aplicação das substâncias. A eutanásia foi realizada em datas pré-detreminadas (7^o, 14^o e 21^o dias). Os grupos Padrão, Água e Milho apresentaram epitélio com duas a três fileiras de células poliédricas e núcleos de diferentes tamanhos e formas. Já no grupo copaíba, o epitélio era constituído de várias fileiras de células (8 a 10 fileiras). Concluiu-se que o óleo de copaíba promoveu aumento de fileira de células da camada epitelial com queratinização no colo uterino de ratas ooforectomizadas.

DESCRITORES: Ratos. Colo uterino. Ovariectomia.

INTRODUÇÃO

Na Amazônia, em virtude da riqueza de sua flora, muitas plantas são utilizadas pela população como alternativas para o tratamento de doenças, é a chamada medicina natural. Isto ocorre embora pouco se saiba sobre seus princípios ativos, mecanismos de ação e toxicidade.

^4,9,14,31 O óleo de copaíba, extraído de uma árvore de grande porte denominada

Copiafera, tem assumido grande importância dentre estas substâncias não só na Região Amazônica como também em outros países para os quais é exportado.

^{1,10,12,15,18,19,20,27,31,32} Tem sido utilizado com fins medicinais como antiblenorrágico, anticatarral, antiinflamatório e cicatrizante. Por via vaginal é aplicado sob a forma de óvulos para o tratamento de cervicites e leucorréia.

^{3,7,8,11,16,17,18,20,24,32} Apesar de ser relatado na medicina popular o amplo espectro de ação, poucos trabalhos experimentais foram encontrados testando sua eficácia. Em virtude da extensa utilização empírica do óleo de copaíba em tratamentos ginecológicos, a despeito do pouco conhecimento acerca do(s) princípio(s) ativo(s), ação e toxicidade,

²⁸ este trabalho tem como objetivo estudar o efeito desta substância no colo uterino de ratas.

MÉTODOS

Como amostra foram utilizadas 12 ratas (

Rattus norvegicus albinus, Rodentia Mammalia), virgens, adultas, com peso de 200 a 250g, oriundas do Biotério do Instituto Evandro Chagas de Belém-Pará e adaptados ao Laboratório de Cirurgia Experimental da Universidade do Estado do Pará por um período de 15 dias, recebendo água e ração

ad libitum durante todo o experimento. Os animais foram distribuídos em 4 grupos de estudo constituídos por 3 animais cada: Grupo Água (GA), Grupo Milho (GM) e Grupo Copaíba (GC), conforme a substância a ser aplicada, e ainda um Grupo Padrão (GP) constituído por animais que não receberam tratamento. Todos os animais foram subdistribuídos em subgrupos de acordo com a data determinada para eutanásia, padronizadas como 7º, 14º e 21º dias após o início do tratamento. Os animais foram submetidos a ooforectomia bilateral por via ventral sob anestesia inalatória com éter etílico, sendo mantidos em gaiolas com ambiente controlado por 20 dias para então, ser iniciada a aplicação da substância de acordo com o grupo a que pertencesse. No 21º dia após a ooforectomia, ou seja, no dia zero do experimento (D0), foi colhido conteúdo do 1/3 inferior da vagina, utilizando-se hastes com algodão embebido em solução salina a 0,9%.

^2,23 Após colhido, o material foi distribuído sobre lâmina, sendo então, mergulhada em solução de álcool absoluto para posterior coloração pelo método de HARRIS-SHOOR.

^2,26 Nos Grupos Água, Milho e Copaíba foram aplicados respectivamente água destilada esterilizada, óleo de milho e óleo de copaíba na sua forma

in natura. De acordo com cada grupo, foi aplicado por via vaginal 0,3 ml da substância correspondente, utilizando-se seringas descartáveis. No Grupo Padrão não houve aplicação de substância, sendo estes animais submetidos apenas à ooforectomia e posterior estudo do colo uterino dos animais.

O óleo de milho utilizado foi adquirido comercialmente e era composto por gorduras poliinsaturadas, monoinsaturadas e saturadas. A cultura para cocos e bacilos apresentou-se negativa. Quanto a análise físico-química, foi observado índice de acidez 0,27%, índice de saponificação 191 mg%, índice de refração 1.465, índice de iodo 113 e índice de peróxido 17,7 mEq/kg.

O óleo de copaíba utilizado foi da espécie Copaifera reticulata Ducke, proveniente da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA – Amazônia Oriental).

Este óleo foi submetido a cultura, análise físico química e criptográfica. A cultura foi negativa para o crescimento de cocos e bacilos. Na análise criptográfica da amostra foi evidenciado a presença de três subclasses terpenóides: sesquiterpenos hidrocarbonetos, sesquiterpenos oxigenados e diterpenos. A análise físico-química evidenciou índice de acidez 79,22%, índice de saponificação 82.34%, índice de refração 1.515, índice de iodo 184.4, índice de peróxido 5,46 mEq/kg.

Os animais foram submetidos a eutanásia em data pré-determinada (7º,14º e 21º) por meio de dose inalatório letal de éter etílico, seguido de retirada da peça contendo o colo uterino.

O preparo das peças foi realizado no Serviço de Microscopia Eletrônica do Instituto Evandro Chagas em Belém-Pará e a descrição e eletromicrografias no serviço de Microscopia Eletrônica da Disciplina de Histologia da UNIFESP-EPM. Cada colo uterino foi dissecado sob lupa e retirados fragmentos de aproximadamente 1mm³ de área , e fixados em solução de glutaraldeído 2% por 2h. Após processamento histológico foi realizada a inclusão dos fragmentos em Epon. Os cortes foram então levados ao ultramicrótomo para obtenção de cortes de 0,5um. Os cortes ultrafinos (60 a 90 nm) foram então analisados em microscópio eletrônico.

RESULTADOS

Todos os grupos no 21^º dia apresentaram a colpocitologia da seguinte forma: escassez de elementos celulares de origem epitelial e grande concentração de leucócitos. Houve predomínio, entre as células epiteliais, de células de pequeno diâmetro, núcleo grande, central e vesiculoso com citoplasma basófilo, características da camada basal. Estavam presentes ainda algumas células da camada intermediária. As células acidófilas, características da camada superficial, eram raras e apresentavam preservação do núcleo e, em algumas, havia sinais de degeneração. Foi observado aumento da concentração de muco.

Quanto aos aspectos ultra-estruturais, os Grupos Padrão, Milho e Água no 7º, 14º e 21º dias foram descritos em conjunto por apresentarem as mesmas características.

O epitélio era constituído de duas a três fileiras de células poliédricas e núcleos de diferentes tamanhos e formas. Núcleos com equilíbrio na distribuição da cromatina sendo eucromático na porção central e heterocromático na periferia. A membrana citoplasmática mostrou grande quantidade de interdigitações e citoplasma pobre em organelas. Foram visibilizadas algumas mitocôndrias e fragmentos de ribossomos dispersos pelo citoplasma. Na região apical das células mais superficiais foram observadas numerosas vesículas eletrotranslucentes se insinuando para a superfície da célula. Nesta, também foram vistos prolongamentos citoplasmáticos formando pequenas vilosidades. A lâmina basal apresentou-se uniforme e levemente retilínea (Fig.1).

Fig.2).

Figs. 3 e

4)

A lâmina própria do Grupo Copaíba apresentou células esparsas, mergulhadas em substância intercelular, constituída por fibrilas colágenas e espaços eletrotranslucentes. Fibroblastos bastante desenvolvidos com núcleos eucromáticos e nucéolos evidentes. Citoplasma com retículo endoplasmático granular e grande concentração de mitocôndrias. Raríssimos leucócitos foram observados. Grande concentração de vasos sanguíneos com luz ampla e célula endotelial com muitas vesículas de pinocitose (

Fig. 5).

DISCUSSÃO

O óleo de copaíba destaca-se dentre as substâncias medicinais de uso popular principalmente na Amazônia como antiinflamatório, cicatrizante e antiinfeccioso por via oral, tópica ou vaginal.

^{1,3,7,8,15,16,17,18,20,24,27,31,32} Embora seja de uso difundido tanto pela população quanto pelo meio médico, pouco se conhece sobre seu efeito via vaginal quando utilizado para o tratamento de cervicites, leucorréia e mesmo displasias de colo uterino.

Com esta finalidade, os animais foram distribuídos no presente estudo de tal forma que GP determinasse parâmetros de normalidade, visto que foram submetidos apenas à ooforectomia e à eutanásia, e GA avaliasse possíveis alterações decorrentes da manipulação e/ou aplicação da substância.

A administração do óleo de milho teve como finalidade observar se as modificações encontradas seriam em decorrência do(s) princípio(s) ativo(s) do óleo de copaíba ou pela característica oleosa da substância.

Com o intuito de minimizar a possibilidade de influência de fatores hormonais presentes no ciclo estral dos animais, foi realizada ooforectomia bilateral para que, desta forma, todos os animais ficassem em anestro, uniformizando a amostra.

O intervalo de 20 dias entre a ooforectomia e a aplicação das substâncias se deveu ao fato de que, após este período, já haveria cessado os efeitos hormonais do ovário no colo uterino.²

O óleo de copaíba utilizado foi proveniente da espécie Copaifera reticulata Ducke, a mais importante do ponto de vista comercial, uma vez que desta é extraído 70% de todo o óleo comercializado no Brasil.^12,18,20,32

O óleo foi aplicado em sua forma in natura pois é desta maneira que o mesmo é utilizado pela população, tendo sido realizadas cultura, análise físico-química e criptográfica para se conhecer seus componentes.

A coleta de material para colpocitologia permitiu concluir, de acordo com as características deste material, que os animais realmente se encontravam em anestro. Estes achados coincidiram com os de MORA (1987),²⁶ BACCI (1988)² e HAMILTON (1947).²²

Os Grupos GP, GM e GA quando comparados entre si nos diferentes subgrupos (7º, 14º e 21º) apresentaram-se semelhantes tanto nas características do epitélio, quanto nos constituintes da lâmina própria. Estes achados são semelhantes aos de MORA (1987)²⁶ quando estudou os aspectos ultra-estruturais do colo uterino de ratas ooforectomizadas, em que observou também uma maior concentração de células e fibras colágenas mais condensadas, assim como fibroblastos bastante atróficos e com pouco citoplasma.

Quanto ao Grupo Copaíba, quando comparados os subgrupos (7º, 14º e 21º) apresentaram aspectos ultra-estruturais semelhantes, quer seja no epitélio ou na lâmina própria.

Em contraste com os demais grupos, o Grupo Copaíba mostrou um aumento no número de fileiras da camada epitelial, além de células anucleadas na camada mais superficial com queratina.

Este epitélio exuberante não deveria estar presente pois o animal não apresentava ação de estrogênio, o que foi confirmado na leitura da colpocitologia no 21º dia após a ooforectomia.

Para determinar tal epitelização, o óleo de copaíba pode ter agido de uma das seguintes maneiras: por efeito pseudo-hormonal, ação de princípio(s) ativo(s) ou irritação tópica que estimule a epitelização.

Este efeito irritante já foi evidenciado por BRITO (1996)⁵ estudando a cicatrização de feridas cutâneas abertas em ratos após aplicação tópica de óleo de copaíba.

BRITO e col. (1999),⁶ por sua vez, ao estudarem o efeito deste óleo no comportamento de ratos observaram agressividade do animal possivelmente decorrente do odor irritativo e ação cáustica.

Um fator importante na queratinização e espessamento do epitélio é a presença de estrogênio, visto que HAMILTON (1947)²² e BACCI (1988),² dias após realizarem ooforectomia em ratas, administraram estrogênios exógenos intraperitoneal e observaram epitelização do tecido com queratinização.

Esta capacidade do estrogênio tem sido explorada no tratamento de certas infecções, particularmente as que ocorrem em mulheres pré-púberes ou pós-menopausa, porque nestas o epitélio é delgado e vulnerável.²¹

Foi observada esta mesma capacidade proliferativa do epitélio com a aplicação do óleo de copaíba no colo uterino de ratas ooforectomizadas, no entanto será necessário comprovar seus efeitos em outros modelos experimentais para que seja indicada a utilização deste óleo.

Conclui-se que para aplicação clínica do óleo de copaíba, deve-se conhecer melhor suas propriedades pois, segundo FERNANDES e col. (1992),¹⁷ embora tenha sido descoberta ação antiinflamatória do óleo de forma experimental, não foi possível determinar qual(s) componente(s) é responsável por tal propriedade.

CONCLUSÕES

O óleo de copaíba utilizado neste modelo experimental provocou aumento de fileira de células da camada epitelial com queratinização no colo uterino de ratas ooforectomizadas. Na lâmina própria, foram observadas células esparsas mergulhadas em substância intercelular e o citoplasma com retículo endoplasmático granular e grande concentração de mitocôndrias.

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Brito NMB, Kulay-Júnior L, Simões MJ, Diniz JÁ, Lamarão LG. Ultraestrutural study of the effects of copaíba oil in uterus colo of rats submitted to bilateral oophorectomy. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Oct-Dec;15(4). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

ABSTRACT: In Amazônia there are a lot of plants used alternatively for diseases. The copaíba oil, extract from a tree called Copaifera, has shown great importance in this context. By vaginal route is apllied for therapeutic of cervicitis and leucohrrea. Because of the large empirically employment of this oil in gynecological treatment, the present study objective to study ultraestruturally the effect of this substance in the rats uterus colo. It was used 12 females rats, adults, distributed in four groups: copaíba oil, corn oil, water and control. All the animals were submitted to bilateral oophorectomy and after twenty days began the substances application. The animals were killed in pre-determined time periods (7, 14 and 21 days). The corn oil, water and control groups showed epithelium with two or three cells filers and copaíba group showed epithelium with eight or tem. It was concluded that copaíba oil promoted an increase in the number of epithelial cells with queratinization in the oophorectomized rats.

SUBJECT HEADINGS: Rats. Cervix uteri. Ovariectomy.

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Nara Macedo Botelho Brito

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Data do recebimento: 10/07/2000

Data da revisão: 28/08/2000

Data da aprovação: 03/09/2000

Datas de Publicação

Histórico