Resumos

Caracterização de biótipos de Staphylococcus aureus isolados de mastite bovina

[Biotyping of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine mastitis]

M.A.V.P. Brito¹, J.R.F. Brito¹, F.M. Cordeiro², W.A. Costa, T.O. Fortes¹

¹

Rua Eugênio do Nascimento, 610

36038-330 - Juiz de Fora, MG

²Bolsista de Iniciação Científica da Fapemig

Recebido para publicação, após modificação, em 17 de março de 2000.

E-mail: mavpaiva@cnpgl.embrapa.br

RESUMO

Duzentos e dezoito amostras de Staphylococcus aureus, isoladas de infecção intramamária de vacas de 44 rebanhos leiteiros, foram classificadas em biótipos de acordo com os testes de produção de estafiloquinase (K), beta-hemolisina (b ), coagulação do plasma bovino (Pl) e crescimento na presença de cristal violeta (CV). As amostras foram distribuídas em 10 biótipos e 63 delas foram classificadas nas ecovariedades bovina (35), ovina (17), aviária (10) e humana (1) e 155 não apresentaram características específicas de hospedeiro. Estas últimas podem ser isoladas de homem, cabra, coelho, suíno, alimentos e de mastite bovina. O biótipo 1, encontrado com maior freqüência (37,2%), apresentou o padrão K (-), b (+), Pl (-) e CV (azul). Em sete rebanhos nos quais se examinaram 10 ou mais amostras, verificou-se que, apesar da ocorrência simultânea de mais de um biótipo por rebanho, houve predominância de um sobre os demais.

Palavras-chave: Bovino, mastite, Staphylococcus aureus, biótipo

ABSTRACT

Two hundred and eighteen strains of Staphylococcus aureus isolated from bovine intramammary infections, obtained from 44 different dairy herds, were classified in biotypes based on staphylokinase (K) and b-haemolysin (b ) production, bovine plasma coagulation (Pl) and growth on crystal violet agar (CV). The strains were assigned to 10 different types, with 63 in the bovine (35), ovine (17), poultry (10) and human (1) ecovars and 155 in non-host specific biotypes. The latter can be isolated from man, goat, rabbit, pig, food, and bovine mastitis. The biotype 1, with reaction pattern K (-), b (+), Pl (-) and CV (blue), was the most frequently found (37,2%). From seven herds ten or more strains were examined. It was found that in spite of the presence of different biotypes per herd, there was always one prevalent biotype.

Keywords: Bovine, mastitis, Staphylococcus aureus, biotyping

INTRODUÇÃO

Mastite bovina é a principal doença do gado leiteiro em todo o mundo devido aos prejuízos econômicos que acarreta ao produtor e à perda da qualidade do leite (Bramley et al., 1996). Dentre os agentes da mastite, Staphylococcus aureus é o mais freqüentemente isolado em diversos países (Booth, 1995; Bramley et al., 1996). No Brasil, relatos de isolamento de S. aureus de mastite subclínica são conhecidos desde o início da década de 50 (Lacerda Jr. et al., 1953-54). Desde então, trabalhos realizados nas regiões Nordeste, Sudeste, Sul e Centro-Oeste do País mostraram a predominância de S. aureus sobre os demais agentes da doença (Brito & Brito, 1996).

Além de participar como patógeno primário da mastite bovina, S. aureus pode estar presente como agente de diversas condições patológicas e como parte da flora endógena de diferentes espécies animais, incluindo o homem (Devriese, 1990). Apesar dessa ampla distribuição, tem-se verificado que a população de S. aureus associada com as diversas espécies animais apresenta algumas características particulares. Meyer (1967) relatou diferenças entre amostras isoladas das espécies humana, bovina e canina que poderiam ser usadas para classificar ecovariedades de acordo com um hospedeiro específico. Posteriormente, Hájek & Marsálek (1971), baseando-se em nove testes bioquímicos e na sensibilidade a fagos, propuseram seis biótipos para caracterizar as amostras de S. aureus e S. intermedius de origem animal. Devriese (1984), utilizando as provas de produção de beta-hemolisina e estafiloquinase, coagulação do plasma bovino e crescimento em meio contendo cristal violeta, descreveu um esquema simplificado para caracterização de biótipos de S. aureus isolados de diferentes espécies animais. Sabe-se que há um biótipo prevalente para cada espécie animal, contudo, os biótipos humano e ovino já foram isolados de bovinos (Hájek & Marsálek, 1971; Devriese, 1984; Farah et al., 1988). A tipificação de amostras isoladas de mastite tem sido investigada como subsídio ao conhecimento da epidemiologia e à identificação de elementos que ajudem no controle da doença (Jaramillo, 1996).

No presente trabalho, amostras de S. aureus isoladas de infecção intramamária bovina foram classificadas em biótipos com o objetivo de obter informação sobre possíveis fontes de infecção para o rebanho.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram empregadas 218 amostras de S. aureus isoladas de infecção intramamária de vacas pertencentes a 44 rebanhos leiteiros localizados em diversas regiões do Estado de Minas Gerais. O número de amostras por rebanho variou de 1 a 27. As amostras foram isoladas a partir de leite coletado antes da ordenha, após cuidadosa anti-sepsia das tetas com álcool a 70%. Os jatos de leite foram coletados diretamente em frascos estéreis, acondicionados em caixas isotérmicas com gelo e encaminhados imediatamente ao laboratório para processamento. Volumes de 10µl de cada amostra foram semeados com alça calibrada, descartável, em cada quadrante de uma placa de ágar-sangue com 5% de sangue desfibrinado de carneiro, de acordo com as recomendações de Harmon et al. (1990). As bactérias identificadas como S. aureus foram caracterizadas por produção de catalase, de acetoína e pela coagulação do plasma de coelho (Barrow & Feltham, 1995). Para a determinação dos biótipos foram realizados os testes de produção de estafiloquinase, ß-hemolisina, coagulação do plasma bovino e crescimento em meio com cristal violeta, de acordo com Devriese (1984).

Para diferenciar reações inespecíficas indicadoras de produção de protease e causadoras de fibrinólise, a produção de estafiloquinase foi realizada em placas de ágar nutritivo com 0,1% (p/v) de fibrinogênio bovino (Sigma) e 0,5% (v/v) de plasma canino (Devriese & Van de Kerckhove, 1980; Devriese, 1984). Placas-controle, sem o plasma canino, foram semeadas em paralelo. Somente foram consideradas positivas as amostras que apresentaram uma zona clara de lise, com bordas definidas nas placas com plasma canino e ausência de lise nas placas sem o plasma canino.

A produção de ß-hemolisina foi pesquisada em ágar-sangue preparado com ágar Columbia (Oxoid), adicionado de 5% de sangue desfibrinado de carneiro. No centro de cada placa foi semeada uma amostra de Streptococcus agalactiae e perpendicularmente a esta foram semeadas as amostras a serem testadas. Todas as amostras de S. aureus que apresentaram reação de CAMP (Christie, Atkins e Munch-Peterson) positiva com a estria de crescimento de S. agalactiae foram consideradas positivas para produção de ß-hemolisina.

O plasma bovino foi obtido a partir de sangue de animais jovens, coletado com EDTA como anticoagulante. Volumes de 0,1ml de crescimento em caldo BHI (Brain Heart Infusion, Biobrás) foram adicionados a 0,5ml do plasma diluído a 1:3 e incubados a 37^oC. Somente foram consideradas positivas as amostras que formaram um coágulo compacto, firmemente aderido às paredes dos tubos, até seis horas de incubação. Reações na forma de pequenos grumos ou coágulos soltos não foram consideradas.

O teste do crescimento em meio com cristal violeta foi feito em placas de ágar-soja tripticaseína (Oxoid) com 1,0 µg/ml de cristal violeta. As placas foram semeadas em "spots" e após 24 horas de incubação, o crescimento foi classificado como C (coloração azul) ou A (coloração amarela).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados da classificação das amostras de S. aureus em biótipos são apresentados na Tab. 1. Considerando-se o padrão de resultados nos testes de produção de estafiloquinase (K), b-hemolisina (b), coagulação de plasma bovino (Pl) e crescimento em presença de cristal violeta (CV), as 218 amostras distribuíram-se em 10 biótipos diferentes. Sessenta e três amostras (29%) foram classificadas em ecovariedades hospedeiro-específicas, enquanto 155 (71%) não apresentaram características específicas de hospedeiro.

Os biótipos relativos a hospedeiros específicos foram: bovino (35), ovino (17), aviário (10) e humano (1). Considerando-se que as amostras de S. aureus testadas foram isoladas de mastite bovina, esperava-se encontrar maior freqüência do biótipo bovino. A distribuição desse biótipo entre amostras de S. aureus isoladas de mastite bovina tem sido variada. Predominou entre as amostras examinadas por Hájek & Marsálek (1971) e Devriese (1984), com freqüências de 89,1% e 38,3%, respectivamente, porém, não foi relatado por Aarestrup et al. (1995) em 105 amostras examinadas. Farah et al. (1988) testaram 110 amostras de S. aureus isoladas de mastite bovina que apresentaram alfa e delta hemólise. Dessas, 2,7% apresentaram características do biótipo bovino, 77,3% do humano e 20% não apresentaram características específicas de hospedeiro. Com exceção do relato de Farah et al. (1988) que encontraram alta porcentagem do biótipo humano em S. aureus de mastite bovina, os biótipos aviário, ovino e humano têm sido encontrados em proporções menores (Devriese, 1984; Aarestrup et al., 1995), semelhantes às encontradas neste estudo.

Dentre as amostras que não apresentaram características específicas de hospedeiro, 141 foram distribuídas nos biótipos 1, 3, 4 e 8 (Tab. 1). Dentre estes, o biótipo 1 [K(-), b (+), Pl (-) e CV (azul)] foi o que predominou entre todos isolados (37,2%). Amostras com características dos biótipos 1, 3, 4 e 8 foram encontradas entre os S. aureus isolados do homem, da cabra, do coelho, dos suínos, de alimento e de mastite bovina (Devriese, 1984). Aproximadamente 48% de 98 amostras isoladas de mastite na Bélgica (Devriese, 1984) foram classificadas nesses biótipos e os de número 1, 3 e 8 foram encontrados em 51,4% das amostras isoladas de mastite na Dinamarca (Aarestrup et al., 1995). Os biótipos 6 e 9, não relatados por Devriese (1984), foram descritos por Aarestrup et al. (1995), nas freqüências de 7,6% e 5,7%, respectivamente. O grande número de amostras de S. aureus com características de biótipos não específicos de hospedeiro encontradas neste trabalho sugerem a necessidade de se investigar outros testes que possam discriminá-las melhor.

De 27 rebanhos foram analisadas uma ou duas amostras, enquanto que de 17 foram analisadas três ou mais. Dentre os rebanhos nos quais se examinou maior número de amostras, apesar de haver a ocorrência simultânea de mais de um biótipo no rebanho, observou-se que havia sempre um predominante. Na Tab. 2 são apresentados os resultados dos biótipos encontrados nos rebanhos nos quais se examinaram 10 ou mais amostras. O biótipo mais encontrado foi o tipo 1, que apresentou o padrão K (-), b (+), Pl (-) e CV (azul), cuja freqüência variou de 41 a 80%. Em um dos rebanhos, 11 das 19 amostras examinadas (58%) eram do biótipo bovino. É possível que fatores individuais de cada rebanho possam propiciar essa predominância, ou que atributos individuais relacionados à virulência das amostras possam contribuir para sua maior disseminação e permanência entre os animais infectados.

O sistema de "biotipagem" empregado é um método simples, que pode ser usado para estudo de um grande número de amostras, e possibilitou a identificação de 10 biótipos. A presença de biótipos bovino, aviário, ovino e humano e outros não específicos de hospedeiro indicam que foram diversas as fontes de infecção para os rebanhos. A predominância de determinados biótipos no rebanho pode estar, ainda, relacionada com a presença de determinados fatores de risco, sugerindo a necessidade de se identificar esses fatores para que medidas de controle da doença possam ser implementadas com maior eficiência.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG).

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