Resumos

Intoxicação experimental de bovinos com toxina botulínica tipo D

(Bovine experimental intoxication with botulinic toxin type D)

L. Colbachini, R.P. Schocken-Iturrino, L.C. Marquez

Depto. de Microbiologia da FCAV-UNESP

Rodovia Carlos Tonanni km5

14870-000 – Jaboticabal, SP

Recebido para publicação, após modificação, em 2 de fevereiro de 1999.

E-mail: pablo@fcav.unesp.br

RESUMO

Realizou-se uma intoxicação experimental em bovinos, pela administração oral, com diferentes doses de toxina botulínica tipo D. O objetivo foi determinar o tempo de permanência da toxina no sangue circulante de bovinos, pela detecção da toxina no soro mediante bioensaio em camundongos, e de verificar a presença da toxina no fígado, no baço, nos rins e no coração, e no conteúdo ruminal de bovinos que morreram e/ou foram sacrificados. Utilizaram-se 12 bovinos, mestiços, divididos em quatro grupos de três animais cada. Os grupos I, II e III receberam 200DL₅₀/ml, 21.300DL₅₀/ml e 63.200DL₅₀/ml de toxina botulínica, respectivamente, e o grupo IV manteve-se como controle. A toxina foi detectada principalmente no soro dos bovinos pertencentes aos grupos II e III que receberam altas doses do inóculo tóxico, nos quais a toxina permaneceu por um período de um a sete dias após o aparecimento dos primeiros sinais clínicos da doença. A toxina não foi detectada no fígado, no baço, nos rins e no coração, mas o foi no conteúdo ruminal de um bovino do grupo II. A toxina botulínica foi mais facilmente detectada no soro do que nos órgãos dos bovinos, sendo encontrada principalmente quando o animal ingeriu muita toxina, durante a fase inicial da doença e por um período de sete dias.

Palavras-Chave: Bovino, botulismo, toxina, intoxicação experimental

ABSTRACT

With the purpose of generating data to help the laboratory diagnosis of botulism, a bovine experimental intoxication, by oral administration with different doses of botulinic toxin type D was carried out. The objective was to determine the time that toxin can be detected in the circulating blood of bovines, by a mouse bioassay, and also to detect toxin in organs (liver, spleen, kidneys and heart) and in the ruminal contents of bovines that had died or were sacrificed after intoxication. Twelve crossbred bovines were divided into four groups of three animals each. Groups I, II and III received 200DL₅₀/ml, 21,300DL₅₀/ml and 63,200DL₅₀/ml of botulinic toxin, respectively, and group IV was maintained as control. The toxin was detected mainly in the serum of bovines of groups II e III, that received high doses of the toxic inoculum, for a period of 1 to 7 days after signs of illness had appeared. The toxin was not detected in the liver, spleen, kidneys and heart but was found in the ruminal contents of only one bovine of the group II. It was concluded that the botulinic toxin is more easily detected in the serum than in organs of bovines, and it was found out mainly when the animal swallow high amount of toxin and during the initial stage of the illness (7 days).

Keywords: Bovine, botulism, toxin, experimental intoxication

INTRODUÇÃO

Há evidências no Brasil de grandes perdas econômicas provocadas pelo botulismo epizoótico bovino, principalmente em regiões que apresentam deficiência de fósforo (Tokarnia et al., 1970; Fernandez et al., 1989; Dobereiner et al., 1992). A afosforose pode levar os animais à osteofagia, pelo qual se intoxicam ingerindo a toxina botulínica produzida pelo Clostridium botulinum nos ossos e carcaças em putrefação (Jansen, 1963; Santos et al., 1993). Há também casos de intoxicação em bovinos por ingestão de feno, silagem (Prevot & Sillioc, 1955) e cama de frango (Schocken-Iturrino & Avila, 1991; Lobato et al., 1995; Ortolani et al., 1997) contaminados com carcaças de animais em putrefação. De acordo com Smith (1977), o diagnóstico presuntivo de botulismo pode fundamentar-se em dados de anamnese e exame físico, e sua confirmação deve ser feita por meio da detecção da toxina botulínica no soro, no conteúdo intestinal e no fígado, utilizando o método de soroneutralização e inoculação em camundongos. Baldassi et al. (1991) afirmam que, de acordo com o "Center for Disease Control" (CDC), localizado em Atlanta, EUA, a prova in vivo para a pesquisa da toxina botulínica é a de eleição, por ser bastante sensível, de alta confiabilidade e apresentar grande especificidade. Este experimento teve como objetivo verificar a presença de toxina botulínica no soro, nos órgãos e no conteúdo ruminal dos bovinos.

MATERIAL E MÉTODOS

A cepa de Clostridium botulinum tipo D procedia de uma amostra de cama de frango, e para testar sua pureza foi utilizada a técnica preconizada por Smith (1977). Para identificação bioquímica da cepa de C. botulinum foi utilizado o sistema API 20A (Quinn et al., 1994) e a tipificação da toxina botulínica foi feita pelo Ministério da Agricultura e do Abastecimento-Laboratório Regional de Referência Animal-Lara/CLA em Pedro Leopoldo. Para determinar as doses letais em camundongos (DL₅₀) de toxina botulínica, uma alíquota da cultura de C. botulinum foi titulada pelo método proposto por Reed & Muench (1938).

Foram utilizados 12 bovinos, machos, mestiços, com 18 meses de idade, entre 200 e 300kg. Os bovinos foram aleatoriamente divididos em quatro grupos, compostos por três animais cada. Os bovinos dos grupos I, II e III receberam a toxina, por via oral, com o auxílio de uma sonda nasogástrica e os bovinos do grupo IV atuaram como controle não recebendo toxina. As doses administradas foram: grupo I - 200DL₅₀ em camundongos/ml de toxina (volume toxina-1ml/kg); grupo II -21.300DL₅₀ em camundongos/ml de toxina (volume toxina - 5ml/kg); e grupo III - 63.200DL₅₀ em camundongos/ml de toxina (volume toxina - 10ml/kg). Todos os bovinos foram observados por um período de 21 dias. Apenas os animais dos grupos II e III, que receberam altas doses de toxina botulínica, foram necropsiados para coleta de conteúdo ruminal e de fragmentos de fígado, de rins, de baço e de coração.

Para a pesquisa de toxina botulínica no soro sangüíneo foram coletados 5ml de sangue de todos os bovinos no dia da inoculação e posteriormente de 24 em 24 horas, até o sexto dia após a inoculação (DAI). Após esse período, as coletas foram realizadas em intervalos de 72 horas, por um período de 15 dias. O sangue foi coletado por punção da veia jugular, pela manhã, segundo a técnica recomendada por Ferreira et al. (1981). Os soros foram acondicionados em frascos estéreis devidamente etiquetados e mantidos em "freezer" a –20ºC por até 48 horas e inoculados em camundongos. Utilizou-se a técnica de inoculação em camundongos descrita por Smith (1977).

Para a pesquisa de toxina no conteúdo ruminal e em fragmentos de fígado, de rins, de baço e de coração esses órgãos foram coletados separadamente, durante a realização das necropsias, e mantidos em "freezer" a –20ºC por no máximo 10 dias. Esse material foi processado como descrito por Smith (1977) e Tanasugarn (1979).

RESULTADOS

No exame clínico do grupo I, apenas o animal número 2 apresentou andar cambaleante no segundo e terceiro DAI, recuperando-se espontaneamente no quarto dia. No grupo II, os animais 4 (subagudo) e 6 (crônico) apresentaram paralisia flácida dos membros posteriores no quinto e no 11° DAI, e morreram no nono e no 21° DAI, respectivamente. O animal número 5 não apresentou incoordenação motora dos membros, porém permaneceu em decúbito lateral direito no terceiro e quarto DAI. Após esse período notou-se visível melhora em seu quadro clínico e o animal se recuperou espontaneamente. No grupo III, o animal 7 (agudo) apresentou andar cambaleante no segundo DAI, que evoluiu para um quadro de paralisia dos membros posteriores no terceiro e óbito no quarto DAI. O bovino 8 (subagudo) manifestou sinais de paralisia no quarto DAI, e permaneceu cinco dias em decúbito esternoabdominal até a morte, no nono DAI. O bovino 9 não apresentou sinais clínicos durante os 21 dias de observação.

Foi possível detectar a presença da toxina botulínica no soro do bovino 4 (grupo II) e dos bovinos 7, 8 e 9 do grupo III. A toxina foi detectada no bovino 4 até o nono DAI. Nos bovinos 7 e 8 a toxina foi detectada até o quarto DAI e no bovino 9 ela foi detectada apenas 24 horas após a inoculação (Tab. 1).

Os exames de laboratório dos órgãos e do conteúdo ruminal foram realizados apenas com os bovinos dos grupos II e III, nos quais quatro animais morreram e dois foram sacrificados no 21º dia após inoculação. Os resultados revelaram presença de toxina apenas no conteúdo ruminal do bovino 4 do grupo II.

DISCUSSÃO

No presente trabalho utilizou-se a unidade DL₅₀ (dose letal para camundongos) para melhor definir a quantidade de toxina botulínica necessária para causar sintomatologia e/ou morte em bovinos, tal como nos trabalhos de Santos et al. (1993) e Cardoso et al. (1994). No entanto, Santos et al. (1993) e Cardoso et al. (1994) utilizaram a via subcutânea, impossibilitando análises comparativas com este experimento. O único trabalho que utilizou a via oral para inocular toxina botulínica tipo D foi o de Simmons & Tammemagi (1964), mas as doses utilizadas foram expressas em ml/kg de peso vivo dos bovinos inoculados e não em unidades biológicas padronizadas como dose letal para camundongos (DL₅₀).

Os sinais clínicos observados nos bovinos intoxicados experimentalmente corresponderam aos achados de casos clássicos do botulismo bovino, tais como, incoordenação motora, apatia, cabeça voltada para o flanco, decúbito esternoabdominal, paralisia flácida dos membros posteriores e morte por paralisia cardiorrespiratória como descrito por Simmons & Tammemagi (1964), Cardoso et al. (1994), Gul et al. (1994), Ortolani et al. (1997).

O tempo de evolução da doença, desde o início dos sinais clínicos até a morte dos animais, está de acordo com os relatos de Henning (1949), Simmons & Tammemagi (1964), Cardoso et al. (1994) e Ortolani et al. (1997).

Neste experimento, cinco bovinos (três no grupo I, um no grupo II e um no grupo III) apresentaram tolerância à dose oral de toxina botulínica que receberam. Nesses casos, segundo os relatos de Allison et al. (1976) e Kozaki & Notermans (1980), acredita-se que a toxina tenha sido inativada por proteases microbianas existentes no conteúdo ruminal dos bovinos. Entre os bovinos que receberam as doses mais altas do inóculo tóxico (grupos II e III) ocorreram manifestações diferentes do quadro clínico: agudo, subagudo e crônico. Dessa forma, pode-se notar nos três grupos inoculados que houve uma resposta individual e independente da dose de toxina administrada via oral. Entretanto, nos resultados de Simmons & Tammemagi (1964), os sinais clínicos dos bovinos foram proporcionais à dose administrada em cada animal. Esses autores, no entanto, não utilizaram a mesma dose em vários animais, impossibilitando comparações mais detalhadas.

Neste modelo experimental observou-se apenas um caso de botulismo crônico, com manifestação de sinais clínicos no 11º DAI e morte no 21º DAI. Este animal recebeu uma dose elevada de toxina, uma única vez, por via oral, dessa forma, não se pode suspeitar de botulismo toxinfeccioso, como descrito no trabalho de Ortolani et al. (1997). Esses autores acreditam que bovinos com morte tardia (acima de 13 dias) poderiam ter botulismo toxinfeccioso. Nesses casos, uma pequena quantidade de toxina é ingerida inicialmente e pode causar estase intestinal e propiciar um ambiente ideal para que esporos de C. botulinum proliferem e produzam a toxina in vivo. Segundo os autores, o botulismo toxinfeccioso ocorre em potros, cavalos adultos e no homem.

A detecção e identificação da toxina botulínica no soro, no fígado, nas fezes e no conteúdo gastrintestinal (Smith, 1977; Popoff & Lecoanet, 1987; Baldassi et al., 1991) de bovinos com sinais neurológicos típicos são consideradas suficientes para confirmar o diagnóstico de botulismo. No entanto, Jones (1991) relata que a confirmação específica para o diagnóstico de botulismo depende da demonstração da toxina no soro de animais intoxicados, mas em casos avançados (crônicos) a toxina pode causar a doença sem ser detectada no soro, tal como ocorreu com o bovino 6 do grupo II.

O bioensaio em camundongos mostrou resultados satisfatórios para detecção da toxina no soro, por um período de até nove dias após a inoculação da toxina, principalmente nos bovinos que receberam altas doses do inóculo tóxico (grupos II e III). Esses animais apresentaram um quadro clínico agudo e subagudo. Simmons & Tammemagi (1964) e Cardoso et al. (1994) detectaram a toxina no soro de bovinos apenas nos casos hiperagudos. Pelos resultados deste experimento, acredita-se que a toxina possa ser detectada nos casos agudos e subagudos, além dos casos hiperagudos, relatados por outros autores. Em todos esses casos, os animais ingeriram grande quantidade de toxina. Segundo Jones (1991), o bioensaio em camundongos pode detectar apenas a toxina biologicamente ativa.

Neste experimento detectou-se a toxina no soro de um a sete dias após o aparecimento dos primeiros sinais clínicos da doença, em três (33%) dos nove bovinos intoxicados experimentalmente. Pamukcu (1954) foi capaz de demonstrar a presença da toxina no soro em oito (57%) dos 14 bovinos com botulismo, por um período de um a seis dias após o início dos sinais clínicos da doença.

Cardoso et al. (1994) relataram que o diagnóstico laboratorial do botulismo só pode ser comprovado pela demonstração da toxina no soro dos animais que receberam doses mais altas, e que em dois casos o soro foi positivo, mas os animais não desenvolveram sinais clínicos característicos de botulismo. No presente experimento, os resultados laboratoriais estão de acordo com Cardoso et al. (1994), pois a toxina foi detectada nos animais que receberam altas doses de toxina botulínica, além de ter sido detectada em um bovino (9 do grupo III) que não manifestou sinais clínicos de botulismo. Curiosamente, a toxina não foi detectada nos bovinos que receberam a dose mais baixa de toxina (grupo I) e em dois bovinos do grupo II, que receberam alta dosagem tóxica. Nesses casos, acredita-se que a toxina esteja em baixa concentração no soro (Jones, 1991) ou que ela tenha sido inativada por proteases microbianas existentes no conteúdo ruminal dos bovinos (Allison et al., 1976; Kozaki & Notermans, 1980).

Com relação à detecção da toxina no conteúdo ruminal e nos fragmentos do fígado, do baço, dos rins e do coração, ela foi detectada apenas no conteúdo ruminal do bovino 4 do grupo II, confirmando o resultado obtido pela detecção da toxina no soro. Resultados positivos eram esperados nos bovinos do grupo III, que receberam altas doses do inóculo tóxico, principalmente no conteúdo ruminal ou nos fragmentos de fígado. No entanto, Muller (1967) afirma que a toxina detectada no fígado de carcaças de animais que morrem de botulismo provavelmente desenvolve-se durante a última fase da doença ou post mortem, por isso, ela não pode servir como critério de diagnóstico porque a produção da toxina botulínica poderá ocorrer em qualquer carcaça, pois os esporos do C. botulinum são facilmente encontrados no meio ambiente ou no conteúdo intestinal, multiplicando-se em condições de anaerobiose.

Comparando os resultados de detecção da toxina no soro e no conteúdo ruminal e em órgãos, verificou-se que a determinação da toxina nos tecidos pelo exame post mortem, ou no conteúdo ruminal, fornece evidências circunstanciais para o diagnóstico definitivo de botulismo, tal como descrito por Jones (1991).

CONCLUSÕES

A DL₅₀ de 21.300 para camundongos foi suficiente para se obter um quadro clínico subagudo de botulismo em bovinos, pela via oral. Cinco de nove bovinos inoculados com toxina botulínica tipo D apresentaram tolerância à dose oral de toxina botulínica, independente das doses administradas. O teste (bioensaio em camundongos) utilizado para detecção da toxina no soro é satisfatório para os bovinos que recebem altas doses do inóculo tóxico e apresentam quadro clínico agudo e subagudo. O teste para detectar a toxina nos órgãos e no conteúdo ruminal não fornece evidências para o diagnóstico definitivo de botulismo.

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