Resumos

INFLUÊNCIA DE ENZIMAS DE MACERAÇÃO NA PRODUÇÃO DE PUBA¹1 Recebido para publicação em 09/12/97. Aceito para publicação 21/10/98 2 Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial/ ESALQ/ USP. C. Postal 9. CEP 13418-900 – Piracicaba-SP.

Tobias José Barreto de MENEZES^2,*1 Recebido para publicação em 09/12/97. Aceito para publicação 21/10/98 2 Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial/ ESALQ/ USP. C. Postal 9. CEP 13418-900 – Piracicaba-SP. , Silene Bruder Silveira SARMENTO³1 Recebido para publicação em 09/12/97. Aceito para publicação 21/10/98 2 Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial/ ESALQ/ USP. C. Postal 9. CEP 13418-900 – Piracicaba-SP. , Érica Regina DAIUTO⁴1 Recebido para publicação em 09/12/97. Aceito para publicação 21/10/98 2 Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial/ ESALQ/ USP. C. Postal 9. CEP 13418-900 – Piracicaba-SP.

1-INTRODUÇÃO

A fermentação natural de raízes de mandioca, denominada pubagem, é uma etapa fundamental no preparo da puba ou carimã, um alimento disseminado no Nordeste brasileiro e semelhante a diversos alimentos fermentados de origem africana como o fufu e o gari. O processo foi descrito por ALBUQUERQUE [2], DÁRO [8, 9] e GRAMACHO [10]. Durante a fermentação, além da degradação de compostos cianogênicos e formação de substâncias aromáticas, ocorre o amolecimento das raízes, que é indispensável para a obtenção de produto de boa qualidade. ALMEIDA [3] identificou bactérias, leveduras e bolores no líquido de fermentação constatando que os ácidos acético, butírico e lático predominavam na maceração que se inicia a partir de 48 horas e se completa quando a atividade amilolítica é máxima. NAKAMURA [16] acompanhou a atividade amilolítica e proteolítica durante a fermentação da fécula de mandioca mencionando a presença de uma flora variada de microrganismos. Considera-se, entretanto, que o abrandamento da textura de alimentos fermentados esteja associado à ação de enzimas de maceração como as pécticas, celulolíticas e hemicelulolíticas, que degradam a parede celular dos tecidos das plantas [7]. Essas enzimas seriam produzidas pela flora microbiana durante o processo de fermentação ou pelas enzimas endógenas da planta [4]. ALMEIDA [3] mostrou que na pubagem a flora de microrganismos se altera, iniciando-se com enterobactérias e corinebactérias, aos poucos substituídas por bactérias lácticas e bactérias esporuladas, ssurgindo, posteriormente, os fungos Candida, Saccharomyces, Penicillium e Aspergillus. Entre as bactérias, diversas linhagens eram amilolíticas ou pectinolíticas, algumas hidrolisavam tanto o amido como a pectina e outras ainda, nenhum desses substratos. Bactérias láticas importantes na fermentação da mandioca, como Lactobacillus plantarum e Leuconostoc mesenteroides, são produtoras de pectinases [12,19] e fungos Aspergillus são reconhecidamente produtores de enzimas pécticas, celulolíticas e hemicelulolíticas.

O fato de que a introdução de inóculo constituído por Bacillus sp, Clostridium sp, enterobactérias e Klebsiela sp, isolados ou em conjunto, ocasionava lenta maceração da mandioca e que esta era acelerada quando se adicionava líquido da pré fermentação [3] também sugere que a pubagem esteja intimamente relacionada à complexa atividade enzímica. AMPE & BRAUMAN [4] atribuíram a uma ação combinada da pectina metil esterase endógena e de enzimas despolimerizantes exógenas o amolecimento de raízes de mandioca durante o processo fermentativo. Esses autores, entretanto, não detectaram a presença de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas. Um esclarecimento pormenorizado das enzimas envolvidas na pubagem é fundamental pois permitirá conhecer melhor o mecanismo do processo fermentativo para controlá-lo e aprimorá-lo.

Na tentativa de alcançar estes objetivos procurou-se, neste trabalho, detectar enzimas hidrolíticas de maceração: celulase, compreendendo as frações carboximetilcelulase (CMCase) e celulase em papel de filtro (CPf), hemicelulase (xilanase) e poligalacturonase (PG). Em seguida, preparados comerciais contendo estas frações foram utilizadas na pubagem para acelerar o processo contribuindo, assim, para a obtenção de puba padronizada e de melhor qualidade.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Matéria-prima

Raízes de mandioca (Manihot esculenta Crantz) da cultivar Branca de Santa Catarina, aos 12 meses de idade, foram colhidas na Fazenda Areão da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz/USP, em Piracicaba/SP.

2.2 – Pubagem convencional (fermentação natural)

As raízes foram lavadas e descascadas (retirada da película externa). Três a quatro quilogramas de raízes foram pesados e colocados em recipientes plásticos, acrescentando-se água de torneira na proporção de 2 litros para cada quilo de raiz. As raízes permaneceram em fermentação até o seu amolecimento completo, o que durou cerca de 7 dias. Diversos experimentos foram realizados com o propósito de se verificar a influência das enzimas no processo de fermentação. Foram utilizados os preparados enzímicos Celluclast 1.5 L de Trichoderma viride como fonte de celulase e Pectinex Ultra SP-L de Aspergillus niger como fonte de pectinase (poligalacturonase), ambos fornecidos pela Novo Nordisk Bioindustrial do Brasil. Os experimentos foram conduzidos adicionando-se 1, 2 e 3 gramas de enzima por quilograma de raiz. Ao tratamento-testemunha não foi adicionada enzima (fermentação natural). As determinações de pH, acidez titulável e atividades enzímicas foram realizadas em intervalos de tempo regulares, verificando-se também a temperatura do líquido de fermentação. Após a pubagem o líquido foi drenado e as raízes passadas por peneira de alumínio, espalhando-se a massa resultante sobre bandejas de aço inoxidável. As amostras foram secas em estufa com circulação forçada de ar (temperatura de 35° C) durante aproximadamente 48 horas.

2.3 – Métodos

O pH foi determinado em 20ml do líquido, utilizando-se potenciômetro.; a acidez titulável foi determinada segundo as normas analíticas do INSTITUTO ADOLFO LUTZ [11]; as leituras de temperatura foram realizadas colocando-se um termômetro de vidro no centro do recipiente de pubagem. O teor de umidade das raízes foi determinado segundo metodologia da AOAC [1].

As atividades enzímicas do líquido de fermentação e dos preparados enzímicos foram determinadas incubando-se a enzima com seus substratos específicos e determinando-se os açúcares formados após o período da reação pelo método do DNS [15]. Assim, a atividade da CMCase, uma endoglicanase, foi determinada incubando-se 0,5 mL de caldo enzímico em 0,5 mL de carboximetilcelulose a 1,0%, pH 4,8, a 50 °C e durante 30 minutos, de acordo com a metodologia descrita por MANDELS [13]. O efeito sinérgico, que mede o efeito global das frações celulolíticas e que expressa a celulase total, foi determinado em papel de filtro como substrato. Meio mL do caldo enzímico foram incubados com uma fita de papel de filtro Whatman n°1 (50 mg) em tampão citrato pH 4,8, a 50°C e durante 1,0 horas [13]. A atividade da xilanase foi deteminada conforme descrito por MENEZES, BEBER & PEREIRA [14] e da poligalacturonase empregando-se o método de THIBAULT & MERCIER [20].

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

Ao se constatar o abrandamento total das raízes, deu-se por concluída a pubagem convencional que, realizada em ambiente a 20-22 ^oC, se completou entre 7 e 8 dias, observando-se modificações físico-químicas durante o processo. A diminuição do pH e o aumento da acidez observados são efeitos comumente relatados em fermentações da mandioca como se verifica nos trabalhos de ALMEIDA [3] e BAUMAN et al. [6]. Estes aumentos foram acompanhados pelos aumento das frações celulolíticas, CMCase e celulase em papel de filtro, da xilanase e da poligalacturonase. Atividades enzímicas muito baixas no início da fermentação natural, aumentaram consideravelmente a partir do terceiro dia até o final da fermentação. As atividades da poligalacturonase, contudo, salientaram-se desde o início, aumentando cerca de 30 vezes do segundo para o sétimo dia (Figura 1). As enzimas degradadoras foram provavelmente produzidas pelos microrganismos envolvidos no processo de pubagem, que se encontravam presentes na flora natural das raízes. O envolvimento de enzimas na fermentação da mandioca, todavia, não está totalmente esclarecido. PADMAJA, BALAGOPAL & POTTY [18] detectaram celulase, amilase, poligalacturonase e pectinesterase em raízes de mandioca frescas e durante o armazenamento em condições naturais até 8 dias. Estes pesquisadores atribuem às enzimas despolimerizantes a degradação dos substratos pécticos, não excluindo, porém, a possibilidade da participação de transeliminases no processo. Segundo BRAUMAN et al [6], o rompimento da parede celular da mandioca é atribuído à ação simultânea da pectina metil esterase e da pectato liase. OKAFOR, IJIOMA & OYOLU [17] encontraram atividade da poligalacturonase além da pectinesterase em fermentações da mandioca esterilizada e inoculada com Corynebacterium. O papel desempenhado pelas enzimas pécticas no amolecimento das raízes foi salientado por AMPE & BRAUMAN [4], atribuindo-o à ação combinada da pectina metil esterase endógena, que atua na primeira etapa do processo rompendo a parede celular, e de enzimas despolimerizantes exógenas de bactérias. Enzimas celulolíticas e xilanolíticas não estariam envolvidas no processo de fermentação no período de 44 horas. Neste trabalho, contudo, verificou-se que além da poligalacturonase as enzimas celulase e xilanase, que participam da degradação da parede celular das plantas, também estão presentes na fermentação da mandioca. Embora não tenha sido possível associar a presença dessas enzimas com o amolecimento das raízes, elas atuam, juntamente com a poligalacturonase, acelerando o desenvolvimento da acidez. A elevada atividade encontrada desta última enzima poderia explicar a importância da sua participação no amolecimento das raízes uma vez que uma das conseqüências da sua ação é a redução da viscosidade de polpas de frutas.

O fato de que a adição de preparados enzímicos também não tenha favorecido o amolecimento das raízes durante a pubagem sugere que enzimas endógenas da planta preponderam neste processo e que enzimas despolimerizantes, além de acelerarem a fermentação pelo aumento da acidez, complementam o abrandamento das raízes.

A pubagem é considerada uma fermentação lática natural, semelhante à que ocorre com outros vegetais como o pepino e repolho na fabricação do picles e chucrute, respectivamente. Uma microflora variada, observando-se uma seqüência de microrganismos, em que predominam, inicialmente, enterobactérias e bactérias láticas [3] é, ao final da fermentação, acrescida de bolores e leveduras. Algumas espécies de bactérias láticas como Lactobacilus plantarum e Leuconostoc mesenteroides são produtoras de enzimas pectinolíticas [12,19]. Os Aspergillus, normalmente presentes no final da pubagem , são produtores de xilanases e de celulases.

Acelerando a fermentação e reduzindo o teor de fibras, as celulases e xilanases contribuiriam, juntamente com as pectinases, para modificar as características físico-químicas do amido melhorando suas propriedades funcionais.

A adição de preparados comerciais de pectinase e celulase acelera a pubagem, antecipando a estabilização do pH e da acidez. Quanto maior a concentração de enzima, mais rápida a redução do pH e o aumento da acidez. Assim, enquanto o pH se estabilizou em 5,2 pela fermentação natural no oitavo dia, com adição de pectinase (Figura 2) este valor foi alcançado entre o segundo e terceiro dia de fermentação para todas as concentrações de enzimas empregadas. Em relação à acidez titulável, o máximo valor alcançado na fermentação natural foi de 0,25 ml no oitavo dia, enquanto nos tratamentos com enzima esse mesmo valor foi alcançado entre o quarto e quinto dia de fermentação. No entanto, adicionando-se apenas 1 grama de celulase por quilograma de raízes, o aumento de acidez titulável foi maior do que quando se adicionaram concentrações maiores da enzima (Figura 3). Enquanto pela fermentação natural o pH atingiu o valor 5,0 após o oitavo dia, os tratamentos com enzimas atingiram esse valor muito mais cedo (após o terceiro dia do processo). O valor máximo de acidez titulável também foi alcançado mais precocemente. Assim, no último dia da fermentação natural este valor foi de 0,40 ml, enquanto que adicionando-se enzimas, o mesmo valor foi atingido após o quarto dia de fermentação (Figura 3).

Aumentos consideráveis nas atividades de todas as frações enzímicas ocorreram durante a pubagem quando se adicionaram preparados comerciais de celulase e pectinase. As Tabelas 1 e 2 mostram os acréscimos pronunciados das atividades de CMCase, CPf, xilanase e PG em conseqüência das adições dos preparados emzímicos comerciais de celulase e pectinase.. Com a adição de pectinase, no entanto, os aumentos da PG do 4° para o 8° dia de fermentação foram maiores do que os aumentos das demais frações (Tabela 2). Estes aumentos foram superiores ao esperado pela fermentação natural. As enzimas adicionadas e as provenientes dos microrganismos, atuando nos respectivos substratos, formariam compostos indutores que aumentaram a atividade enzímica. Ademais, os compostos hidrolisados serviriam como fonte de energia para o crescimento e multiplicação dos microrganismos.

A adição de preparados enzímicos que teria função semelhante à do líquido da pré-fermentação, porém mais concentrado e puro, embora tenha acelerado a formação da acidez, aparentemente não antecipou o amolecimento das raízes. Os resultados sobre o efeito da adição de inóculo ou líquido da pré-fermentação são controvertidos. ALMEIDA [3] relata que o tempo de fermentação foi reduzido em 25%, adicionando-se 10% do líquido pré-fermento na pubagem. AMPE et al. [5], todavia, concluíram que o líquido da fermentação não é necessário para reduzir o tempo de fermentação e melhorar as qualidades do fufú.

Adicionando-se enzimas em concentrações apropriadas pode-se, todavia, reduzir o período da fermentação, controlar a formação da acidez e, possivelmente, pela diminuição dos teores de pectina e fibras, alterar as propriedades reológicas do amido, tornado-o adequado para a elaboração de diversos produtos alimentícios.

4 — CONCLUSÕES

- A adição de enzimas celulase e pectinase na pubagem acelera a fermentação, aumentando a acidez e reduzindo o pH mais rapidamente em relação ao tratamento-testemunha (sem adição de enzimas).

- A adição de enzimas celulase e pectinase aumenta as atividades de celulase em papel de filtro, em carboximetilcelulase, xilanase e poligalacturonase no decorrer da fermentação, em valores superiores ao esperado pela fermentação natural.

- Durante a fermentação natural há formação de celulase, xilanase e poligalacturonase, sendo que as atividades de cada uma aumentam no decorrer do processo.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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3. ALMEIDA, P.F. de. Processamento e caracterização da puba. Campinas, 1992. 115p. (Doutorado - Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP).

4. AMPE, F. & BRAUMAN, A. Origin of enzymes involved in detoxification and rot softening during cassava retting. World Journal of Microbiology & Biotechnology, v.11, p.178-182, 1995.

5. AMPE, F., BRAUMAN, A., TRECHE, S. & AGOSSOU, A. Cassava retting: optimisation of a traditional fermentation by an experimental research methodology. Journal of Science and Food Agriculture. v.65, p.355-361, 1994.

6. BRAUMAN, A. , KËLÉKÉ, S. , MAVOUNGOU, O. , AMPE, F. & MIAMBI, E. Étude cinétique du rouissage traditionnel des racines de manioc en Afrique Centrale (Congo). In: Cassava Food Processing, eds Agbor-Egbé, T., Brauman, A., Griffon, D. & Trèche, S. ORSTOM , Paris, p.287-305, 1995.

7. CODNER, R.C. Pectinolytic and cellulolytic enzymes in the microbial modification of plant tissues. Journal of Applied Bacteriology, v. 34, n.1 , p. 147-160, 1971.

8. DÁRO, N. A mandioca: alguns tipos de farinhas. Campo, v.8, p. 46-48, 1937 a.

9. DÁRO, N. A mandioca: alguns tipos de farinhas.II. Campo, v.8, p. 69-70, 1937 b.

10. GRAMACHO, D. D. Ensaios sobre a utilização da matéria-prima de mandioca (Manihot esculenta, Crantz) na obtenção de "carimã e polvilho azedo". Nota prévia. In: Projeto mandioca. Ano II, Cruz das Almas, 1975, 187p. (Série pesquisa).

11. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. 3.ed. São Paulo, 1986. v.1. 533p.

12. JUVEN, B. J., LINDNER, P. & WEISSLOWICZ, H. Pectin degradation in plant materials by Leuconostoc mesenteroides. Journal of Applied Bacteriology, v. 53, p. 533-538, 1985

13. MANDELS, M. Production and application of cellulase. Natick, 1974. USA- Laboratory Procedures. US. Army Natick Laboratories. 22p.

14. MENEZES, H.C. de, BEBER, J.E. & PEREIRA, W.A. O uso de resíduos na produção de xilitol. I. A produção de xilose. Coletânea do Ital, v.7, p.439-443, 1976.

15. MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. v. 31, n. 3, p. 426-428,1959

16. NAKAMURA, I. M. Contribuição ao estudo da fécula de mandioca fermentada. Campinas, 1975. (Mestrado- Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agrícola, UNICAMP). 80p.

17. OKAFOR, N., IJIOMA, B. & OYOLU, C. Studies on the microbiology of cassava retting for foo-foo production. Journal of Applied Bacteriology, v.56, p.1-13, 1984.

18. PADMAJA, G., BALAGOPAL, C. & POTTY, P. Cellulolytic and pectinolytic enzyme activities of deteriorating cassava roots. Journal of Root Crops, v.8, n.1/2, p.35-40, 1982.

19. SAKELLARIS, G., NOKOLAROPOULOS, S. & EVANGELOPOULOS, A. E. Purification and characterisation of an extracellular polygalacturonase from Lactobacillus plantarum strain BA 11. Journal of Applied Bacteriology, n. 67, p.77-85, 1989.

20. THIBAULT, J.F. & MERCIER, C. Aspergillus niger endopoligalacturonase: characterization and some properties. Journal of Food Biochemistry, v.2, n.4, p.379-395, 1978.

6 — AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pelo auxílio concedido.

³ Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial/ ESALQ/ USP. Caixa Postal 9. CEP 13418-900 – Piracicaba-SP.

⁴ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo / FAPESP .

* A quem a correspondência deve ser endereçada.

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