Resumos

FÉCULA E FARELO DE MANDIOCA COMO SUBSTRATO NA PRODUÇÃO DE CICLODEXTRINAS¹ 1 Recebido para publicação em 13/6/97. Aceito para publicação em 31/07/98.

Andréa C. BERTOLINI² 1 Recebido para publicação em 13/6/97. Aceito para publicação em 31/07/98. ,^* 1 Recebido para publicação em 13/6/97. Aceito para publicação em 31/07/98. , Marney P. CEREDA³ 1 Recebido para publicação em 13/6/97. Aceito para publicação em 31/07/98. , Gerard CHUZEL⁴ 1 Recebido para publicação em 13/6/97. Aceito para publicação em 31/07/98.

RESUMO

SUMMARY

1 — INTRODUÇÃO

Ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos, compostos de seis, sete ou oito unidades de glucose unidas por ligações do tipo a-1,4, denominadas respectivamente de a, b e g-CD. Devido à sua estrutura cíclica com cavidade hidrofóbica, formam complexos de inclusão com vários compostos, modificando as características químicas e físicas dos mesmos. Proteção contra oxidação, contra degradação pela luz e pelo calor, contra perdas por volatilidade, redução ou eliminação de gostos ou odores desagradáveis, estabilização de drogas, de cores, de vitaminas, de aromas, ou de emulsões, aumento de solubilidade de fármacos e alteração de características químicas são alguns dos efeitos resultantes da encapsulação de compostos por CDs.

O crescente número de patentes sobre o assunto nos últimos 20 anos reflete o interesse da indústria, salientando seu potencial econômico. CDs têm sido empregadas na Hungria e Japão desde 1970. Bélgica, França, Holanda, Itália, Luxemburgo, Espanha e Alemanha são países que têm o uso de CDs aprovado em alimentos. Nos EUA, CDs começaram a ser produzidas recentemente. No Japão, o maior produtor de CDs, cerca de 70% da produção é destinada à indústria alimentícia, sendo o restante da produção usada na indústria farmacêutica [21]. O fator limitante à sua utilização é o alto custo de produção, superior ao dos amidos modificados [11; 16]. Segundo STARNES [21], em 1990 o preço da g-CD oscilava entre U$200 e 1.200/kg, a a-CD estava cotada a U$40/kg e a b-CD entre U$15-20/kg. O mesmo autor afirma que, para que a b-CD seja economicamente viável, seu preço deve ser próximo a U$5/kg e estima que, nos EUA, o mercado potencial de CDs movimentaria 32.000 toneladas por ano; o equivalente a U$245 milhões.

Visando a redução dos custos de produção de CDs, trabalhos sobre a otimização de atividade da CGTase e das condições de reação e métodos de recuperação de CDs e de purificação de CGTases, têm sido frequentes [21]. Há também trabalhos que relatam a obtenção de CDs ramificadas, como as malto-b-CDs, visando sua maior solubilidade e, consequentemente, a redução do seu custo de obtenção [24]. Porém são poucos os que enfocam a minimização dos custos do substrato. De acordo com RAJA et al. [18], a fécula de batata e o amido de milho são os substratos mais frequentes na produção de CDs, sendo a fécula de batata doce também esporadicamente empregada. Devido à sua rápida liquefação, a fécula de mandioca é considerada como excelente matéria prima para produção de CDs [17].

As fecularias de mandioca estão distribuídas por todo Brasil, variando quanto ao tamanho, onde as de médio e grande porte chegam a processar mais de 400 toneladas por dia. O farelo é um resíduo gerado na etapa de extração da fécula e possui, em média, 15% de fibras e 70% de amido. A produção de fécula de mandioca no Brasil frequentemente apresenta grandes oscilações, mas é superior a 200.000 toneladas/ano, estimando-se que a de farelo seco é próxima a 50.400 toneladas/ano [8]. Esse trabalho tem por objetivo comparar a produção de CDs usando fécula e farelo de mandioca como substratos.

2 — MATERIAL E METODOS

Matéria-prima

Foram empregados como substratos fécula e farelo de mandioca cedidos pela Fecularia Botega, localizada na região de Cândido Mota — S.P., obtidos por processo de extração industrial. O farelo, após secagem em estufa durante 10 horas a 25°C, foi moído em moinho tipo Willey, com peneira de malha de 1,23 mm de diâmetro. Os substratos foram caracterizados quanto aos teores de umidade, proteína, amido, matéria graxa, cinzas, fibras [3], pH e acidez [9]. A amilose foi determinada pelo método ISO-6647 e o valor obtido expresso em porcentagem sobre o teor de amido.

Enzimas e Reagentes

Ciclodextrina glucosiltransferase (CGTase E. C. 2.4.1.19) de Bacillus macerans da Amano International Enzyme Co. Inc. (Nagoya, Japão), com mais de 600 unidades/ml [22] foi usada para a produção de CDs. A unidade da CGTase é definida como sendo a quantidade de enzima necessária para produzir 1 mml de CDs/minuto a partir de amido solúvel de batata em pH 6,0 a 60°C [19].

O preparo das amostras para quantificação de CDs foi feita com b-amilase (E.C. 3.2.1.2) da Sigma (A 7130), proveniente de cevada, com 53 unidades/ mg de matéria seca, sendo 1 unidade equivalente à liberação de 1 mg de maltose/3 min., em pH 4,8 a 20°C.

Como padrões para curvas de calibração foram usados glucose monohidratada (C 04319) da Cinética Química Ltda., maltose (400) da Vetec Química Fina Ltda., amido solúvel de batata Reagen Químibrás Ind. S. A. (10037) e a-CD (C-4642) (97% pureza) e b-CD (C-4767), ambas da Sigma.

Delineamento experimental

O delineamento foi feito em blocos com parcelas subdivididas ("split-splot"), tendo fécula e farelo (T) como tratamentos principais (parcelas) e tempo (t) como tratamento secundário (subparcelas), constando de três repetições por tratamento [5]. O programa computacional usado para análise dos dados foi Statistical Analysis System (SAS).

Produção de CDs

Suspensões contendo 5% de substrato foram submetidas a liquefação prévia do amido usando 1 ml de CGTase a 80°C por 15 minutos no caso da fécula, e 40 minutos para o farelo. Quando a solução atingiu 50°C; foi acrescentado 1 ml de CGTase. A reação foi completada em copo hermético de aço inoxidável, provido com uma haste acoplada a agitador mecânico, imerso em banho-maria durante 24 horas. Coletou-se amostras após a liquefação e após 2, 4, 6, 8, 10, 12, 22 e 24 horas de reação.

Preparo das amostras

Devido a viscosidade da suspensão de farelo, foi realizada prensagem visando recuperar material líquido para análise.A inativação enzimática foi feita através de tratamento térmico 90-100°C /15 minutos. As suspensões foram centrifugadas e o precipitado, descartado. As amostras foram analisadas quanto ao teor de amido residual, quanto à quantidade de extremidades redutoras e produção de CDs.

Devido ao tempo de eluição da a-CD ser coincidente com o das dextrinas lineares de grau de polimerização (GP) 6-7, as amostras destinadas à quantificação de CDs foram acrescidas com 0,5 ml de b-amilase a 0,002 g/ml a 25°C durante 1 hora. A inativação enzimática foi feita a 90-100°C/15 minutos, seguida de centrifugação a 12.000 rpm/ 15 minutos [2].

Análises

As amostras foram avaliadas quanto ao amido residual (amido solúvel não hidrolisado) através do método de coloração de iodo e leitura em espectrofotômetro a 620 nm [4].

As extremidades redutoras (ER) foram quantificadas pelo método do ácido dinitrossalicílico (DNS) com leitura a 535 nm.

A quantificação de a e b-CDs foi feita através de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) [10], com coluna Aminex HPX-42 A (300 x 7.8 mm) Cat. 125-0097 usando água deionizada e filtrada como fase móvel e a leitura foi feita através do detector de interface dielétrica Refracto Monitor IV LDC. O programa computacional usado para registro e tratamento dos cromatogramas foi CHROMA V. 3.18, da Biosystemes.

3 — RESULTADOS E DISCUSSAO

A principal diferença observada na caracterização dos substratos foi o alto teor de fibras presente no farelo, o que resultou em aumento considerável da viscosidade da suspensão quando comparado à suspensão de fécula. Os teores de matéria graxa e cinzas do farelo também são consideravelmente maiores que os da fécula. Os valores para amido, proteína, fibras e amilose da fécula encontram-se próximos aos valores observados por WOSIACKI et al. [23]. O teor de amido observado no farelo (74,21%) foi próximo ao teor médio de amido presente em farelos provenientes das fecularias do sudeste brasileiro, que é 73,78% [8].

Apesar das diferenças na composição dos substratos, os perfis observados nos cromatrogramas foram semelhantes em ambos tratamentos, ou seja, não houve diferença em relação aos produtos obtidos (Figuras 1 e 2). Houve porém maior produção de CDs e de maltose quando o substrato foi fécula. A utilização de b-amilase auxiliou na identificação dos picos referentes à a-CD, uma vez que as dextrinas lineares de GP 6-7 foram hidrolisadas em cadeias menores.

Com os padrões usados não foi possível identificar o pico com tempo de eluição de 20,8 minutos, observado em ambos cromatogramas, sendo provável a hipótese destes serem correspondentes à resíduos da CGTase desnaturada.

Os resultados que comparam a produtividade dos dois substratos estão representados na Figura 3. A produção de a-CD, tanto a partir de fécula como de farelo, atingiu valor máximo após duas horas de reação. No teste de Tuckey, apenas o tempo t1; correspondente à fase de liquefação, diferiu dos demais tempos (Tabela 2). Quanto a produção de a-CD, não houve diferença significativa entre os tratamentos de fécula e farelo. Não houve interação significativa entre T x t, ou seja, os tratamentos relativos aos substratos não apresentaram interação com o tempo, ao longo da reação (Tabela 3).

Ao contrário da produção de a-CD, a de b-CD diferiu significativamente em relação aos substratos usados (Tabela 3). Houve diferença significativa entre a quantidade de b-CD produzida durante a fase de liquefação dos substratos e os demais tempos e também entre a quantidade de b-CD produzidas entre as primeiras quatro horas e após 24 horas de reação (Tabela 2). A produção de b-CD após 24 horas não apresentou diferença da produção nos tempos 6, 8, 10, 12 e 22 horas e não houve interação significativa T x t. Quando se usou fécula como substrato, a produção de b-CD foi superior para todos os tempos (Figura 3). As proporções de a:b-CDs após 24 horas de reação, foram de 1,5: 1,0 e 1,0:1,45 para o farelo e a fécula, respectivamente.

KITAHATA e OKADA [12] constataram que a CGTase produzida pelo B. macerans forma preferencialmente a-CD, enquanto que a CGTase produzida pelo B. megaterium resulta em maior proporção de b-CD. Segundo NORMAN e JØRGENSEN [15], a CGTase do B. macerans produz a proporção de 2,1:1,0:1,0 de a:b:g-CDs. Entretanto RENDLEMAN [19; 20] afirma que estas proporções relativas podem variar consideravelmente de acordo com a temperatura de reação, com a presença de agentes complexantes e de aceptores e com a natureza do substrato. RENDLEMAN [20] concluiu que, a baixas temperaturas, a presença de alcoóis não ramificados como agentes complexantes favorece a produção de a-CD, enquanto que os alcoóis ramificados favorecem a produção de b-CD.

Em relação ao teor inicial de amido presentes nos substratos, a conversão em a-CD foi de 19% para a fécula e 21% para o farelo. Para b-CD, os valores foram de 27% e 15% para fécula e o farelo, respectivamente. Estes resultados concordam com os de NAKAMURA e HORIKOSHI [14], os quais afirmam que, após 60 minutos de reação, 25-30% do amido inicial foi convertido em CDs e que a concentração e a natureza do substrato apresentam considerável influência na quantidade e no tipo de CDs produzidas.

O mecanismo de ação da CGTase ainda não foi totalmente elucidado, mas sabe-se que a enzima apresenta a habilidade de interagir com amido solúvel ou cadeias longas de oligossacarídeos através de reações de hidrólise, ciclização ou desproporcionalização. A CGTase também catalisa a reação de transglicosilação intermolecular, na qual os resíduos de glucose são transferidos de uma molécula de CD ou de uma cadeia linear de oligossacarídeos para um monossacarídeo ou um oligossacarídeo aceptor [20].

A produção de extremidades redutoras da reação com farelo foi significativamente menor que a da reação com fécula (Tabela 3), e é decorrente da menor eficiência da ação enzimática no farelo devido ao seu alto teor de fibras e impurezas. Em ambos substratos, a produção de extremidades redutoras ocorreu nas primeiras horas de reação, estabilizando-se após 4 horas. Tal estabilização da produção de extremidades redutoras pode ser atribuída a maior atividade de hidrólise da CGTase nas primeiras horas de reação ou ao aumento da velocidade da reação de ciclização; que também contribui para a redução da quantidade de extremidades redutoras presentes no meio. Porém, devido ao patamar observado na produção de CDs após as primeiras horas (Figura 3), a hipótese de perda de atividade enzimática durante a reação deve ser considerada como principal fator da estalibilização da produção de extremidades redutoras.

A quantidade de amido solúvel não hidrolisado na fécula foi significativamente menor que a do farelo (Tabela 3). Houve diferença significativa também entre os tempos de reação (subparcelas), onde apenas o tempo t1 diferiu dos demais (Tabela 2). Não foi observada interação significativa entre T x t. A maior parte do amido é hidrolisado durante as duas primeiras horas de reação, o que está de acordo com os valores encontrados para produção de CDs. Após este período, ocorre uma estabilização da reação de hidrólise promovida pela CGTase. Estes resultados reforçam a hipótese de perda de atividade enzimática após as primeiras horas de reação. Segundo ABE et al. [1], a hidrólise do amido promovida pela CGTase é muito pequena quando comparada à reação de transglicosilação. Tal observação ressalta que a reação de hidrólise, após as primeiras horas, passa a ter menor expressão quando comparada às reações de transglicosilação e ciclização.

Segundo RENDLEMAN [19], a termoestabilidade da CGTase do B. macerans é maior a 50°C, temperatura na qual 99% de atividade da enzima é conservada após 10 minutos de reação. Os mesmos autores afirmam que, para o mesmo tempo de reação, a 60°C apenas 93% de atividade da enzima é conservada e que apenas 3% da atividade da enzima é mantida pós 8 horas de reação a 60°C. A maioria dos trabalhos sobre a CGTase proveniente do B. macerans monitoram a reação entre 40-60°C, mas resultados obtidos por RENDLEMAN [20] indicam que a baixas temperaturas (0-25°C) a CGTase é extremamente estável e que a taxa conversão de maltodextrinas em CDs é igual ou maior à obtida quando a reação se processa em altas temperaturas. Este autor concluiu que, quando conduzida a baixas temperaturas e na presença de complexantes adequados, a reação da CGTase com maltodextrinas resulta em altas taxas de conversão do substrato em CDs. FLASCHEL [6] afirma que o aumento da temperatura promove aumento da atividade enzimática, mas também é responsável pelo aumento da velocidade de desativação e a 50°C a CGTase é estável durante 6 horas. A estabilidade térmica da enzima aumenta consideravelmente na presença de amido [6, 7, 11, 13, 14], sugerindo proteção da desnaturação [11] e, quanto menor a concentração de substrato, mais cedo o patamar da reação é atingido [6]. Para concentração de 50 g/l a estabilização ocorre após 4 horas de reação e para 300 g/l após 10 horas de reação [6]. Tais afirmações concordam com os resultados obtidos, uma vez que a concentração de substrato usado foi equivalente a 50 g/l e a concentração de amido diminuiu consideravelmente após duas horas de reação. O aumento da concentração de CDs também pode ter contribuído para a queda da atividade da CGTase, que segundo KIM et al. [11], pode ser inibida pela presença de b-CD.

4 — CONCLUSÕES

Os resultados obtidos permitem concluir que a produção de CDs usando fécula e farelo como substrato é viável e que o farelo é um substrato adequado quando se visa a produção de a-CD, enquanto que a fécula é um substrato que pode ser empregado tanto para a produção de a-CD como a de b-CD. O emprego do farelo como substrato apresenta-se como alternativa promissora para redução de custos na produção de CDs, sendo também uma forma de aproveitar esse resíduo gerado pelas fecularias.

Nas condições de reação a 50ºC, tanto a hidrólise de amido quanto a produção de extremidades redutoras, CDs estabilizam-se após 4 horas de reação, indicando perda considerável da atividade enzimática, sugerindo que não há necessidade de prorrogar a reação.

A enzima CGTase de Bacillus macerans utilizada produz a e b-CD em proporções diferentes de acordo com o substrato empregado, sendo que, nas condições de ensaio, sua ação sobre o farelo possibilita maior produção de a-CD que de b-CDs (1,5:1,0), enquanto que quando se emprega fécula a produção de b-CDs é favorecida (1,0:1,45).

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] ABE, S.; NAGAMINE, Y.; OMICHI, K.; IKENAKA, T. Investigation of the active site of Bacillus macerans cyclodextrin glucanotransferase by use of modified maltooligosaccharides. Journal of Biochemistry, 110:756-61, 1991.

[2] ALVAREZ, H.; BERTOLINI, A. C.; CEREDA, M. P.; CHUZEL, G. Condiciones de analisis de las ciclodextrinas por HPLC. In: VIII Seminarios Latinoamericanos y del Ciencia e Tecnologia de Alimentos. pg. 103, Montevideo, 16-21 de outubro de 1994.

[3] ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis. 13. ed. Washington, D.C., 1980. 109 p.

[4] BANKS, W.; GREEWOOD, C. T.; KHAN, K. M. The interaction of linear, amylose oligomers with iodine. Carbohydrate Research, 17: 25-33, 1971.

[5] BANZATTO, D. A.; KRONKA, S. N. Experimentação Agrícola. Jaboticabal, FUNEP. 1989. 247p.

[6] FLASCHEL, E.; LANDERT, J. P.; SPIESSER, D.; RENKEN, A. The production of alfa-cyclodextrin by enzymatic degradation of starch. Part II. Enzyme processes and processing steps of industrial interest. Annals New York Academy Sciences, New York, 434: 70-7, 1984.

[7] FUJIWARA, S.; KAKIHARA, H.; WOO, K.B.; LEJEUNE, A.; KANEMOTO, M.; SAKAGUCHI, K.; IMANAKA, T. Cyclization characteristics of cyclodextrin glucanotransferase are conferred by the NH₂-Terminal region of the enzyme. Applied and Envirommental Microbiology, 52(12): 4016-25, 1992.

[8] GRIFFON, D. Valorisation des produits, sous-produits et dechets de la petite et moyenne industrie de transformation du manioc en Amerique Latine. Montpellier: CIRAD, 1995. 1 v. (CEE/STD3 n.TS3-CT2-0110).

[9] INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. Métodos químicos e físicos para análise em alimentos. 3 ed. São Paulo, 1985. v. 1, 126 p.

[10] KANEKO, T.; KUDO, T.; HORIKOSHI, K. (1) Comparison of CD compopsition produced by chimeric CGTases. Agricultural and Biologycal Chemistry, 54(1), 197-201, 1990.

[11] KIM, T.J.; LEE, Y.D.; KIM, H.S. Enzymatic production of cyclodextrins from milled corn starch in an ultrafiltration membrane bioreactor. Biotechnology and Bioenginnering, 41(1):88-94, 1993.

[12] KITAHATA, S.; OKADA, S. Action of cyclodextrin glycosyltransferase form Bacillus megaterium strain n.5 on starch. Agricultural and Biological Chemistry, 38(12):2413-7, 1974.

[13] MÄKELÄ, M.; PAAVILAINEN, S.; KORPELA, T. Growth dynamics of cyclodextrin glucannotransferase producing Bacillus circulans var. alkalophilus.Canadian Journal of Microbiology, 36:176-82, 1990.

[14] NAKAMURA, N.; HORIKOSHI, K. Purification and properties of neutral-cyclodextrin glycosyltransferase of an alkalophilic Bacillus sp. Agricultural and Biologycal Chemistry, 40 (9): 1785-91, 1976.

[15] NORMAN, B.E.; JØRGENSEN, S.T. Thermoanaerobacter sp. CGTase: its properties and applications. Denpun Kagaku, 39 (2):101-8, 1992.

[16] O'BOYLE. A.R.; ALADIM-KASSAM, N.; RUBIN, L.J.; DIOSADY, L.L. Encapsuled cured-meat pigment and its applications in nitrite-free ham. Journal of Food Science, 57(4):807-12, 1992.

[17] RAJA, K.C.M.; RAMAKRISHNA, S.V. Improved reaction conditions for preparation off beta-cyclodextrin (b-CD) form cassava (Manihot esculenta Crantz) starch. Starch, 46 (10):402-3, 1994.

[18] RAJA, K. C. M.; SREEDHARAN, V. P.; PREMA, P.; RAMAKRISHNA, S. V. Cyclodextrin from cassava (Manihot esculenta Crantz) starch. Isolation and characterization as bromobenzene and chloroform chlathrates. Starch, 42 (5):196-8, 1990.

[19] RENDLEMAN Jr., J. A. Enhanced production of cyclomaltoocatoase (gama-cyclodextrin) through selective complexation with C12 cyclic compounds. Carbohydrate Research, 230: 343-59, 1992.

[20] RENDLEMAN Jr., J. A. Enzimatic conversion of mato-oligosaccharides and maltodextrin into cyclodextrin at low temperature. Biotechnologie and Applied Biochemistry, 24: 129-37, 1996.

[21] STARNES, R. L. Industrial potential of cyclodextrin glycosyltransferase. Cereal Foods World, 35 (11):1094-9, 1990.

[22] TILDEN, E.B.; HUDSON, C.S. Conversion of starch to crystalline dextrins by the action of a new amylase separate from culture of Bacillus macerans. Journal of American Chemical Society, 61;29002, 1939.

[23] WOSIACKI, G.; CEREDA, M. P.; SARMENTO, S. B. S.; ABBUD, N. S. The cassava (Manihot esculenta) c.v. Pioneira. Characteristics of the starch fraction. Agricultural and Biological Technology, 33(2): 255-64, 1900.

[24] YIM, D. K.; PARK, Y. H.; PARK, Y. H. Production of branched cyclodextrins by reverse reaction of microbial debranching enzymes. Starch, 49 (2): 75-78, 1997.

6 — AGRADECIMENTOS E CRÉDITOS

Trabalho integrante do projeto "Valorização dos produtos e subprodutos da mandioca". Parte de dissertação de Tese do primeiro autor, apresentada à ESALQ— USP, financiado pela Comunidade Econômica Européia.

² Mestrado, ESALQ -USP — Cx. Postal 09 CEP: 13. 418-900- Piracicaba — Brasil. Bolsista da Capes.

³ UNESP — CERAT — Cx. Postal 237 CEP: 18.603-910 — Botucatu — S. P. — Brasil.

⁴ CIRAD-SAR. 2477. Avenue du Val de Montferrand. BP 5035 Montpellier — França.

* A quem a correspondência deve ser enviada.

Datas de Publicação

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