Resumos
A maçã (Malus domestica Borkhausen) é uma excelente fonte nutricional e de interesse econômico, sendo que a Região Sul do Brasil contribue com 90% da produção Nacional deste fruto com destaque aos cultivares Gala e Fuji. O objetivo deste estudo foi avaliar a produção de patulina nestes cultivares inoculados com Penicillium expansum NRRL 1172 e Penicillium variabile toxigênico, isolado de maçãs regionais. As frutas contaminadas foram mantidas em condições de tempo de armazenamento e temperatura que variaram respectivamente de 15 a 90 dias e de 0 a 25°C. A produção de patulina ocorreu em todas as combinações de armazenagem e temperaturas empregadas para o ensaio, independentemente dos cultivares. A produção de patulina foi negativa no 30º dia nas maçãs estocadas a 0°C inoculadas com P.expansum, mas o aumento de temperatura para 4°C restringiu a margem de segurança, causando positividade na produção da toxina para ambos os cultivares inoculados com as duas linhagens fúngicas, no mesmo período. Nas maçãs inoculadas com P. variabile ocorreu maior concentração de patulina (F=68,05) do que as contaminadas com P. expansum NRRL 1172 (F=26,0). O risco freqüente de produção de patulina nas temperaturas de refrigeração, indicaram a necessidade de melhor controle nos estágios de colheita e armazenagem de maçãs, a fim de evitar constante ingestão de toxina.
patulina; maçã; Penicillium spp.
The apple (Malus domestica Borkhausen) is an excellent nutritional source of economical interest, with emphasis to the Brazilian Southern Region which comprises 90% of national apple production, mainly Gala and Fuji cultivars.The aim of this research was to evaluate patulin production in both cultivars, inoculated with Penicillium expansum NRRL 1172 and a toxigenic P. variabile strain isolated from commercialized apples. Samples for analysis were taken from apples stored under combined conditions of time and temperature, which ranged from 15 to 90 days period and 0 to 25°C, respectively. Patulin was produced throughout the storage temperatures assayed with both Penicillium strains. The patulin production was negative until 30th day in apples stored at 0°C, but increase of temperature to 4°C restricted the safety threshold. P. variabile produced higher concentration of patulin in inoculated apples (F=68,05) more than P. expansum NRRL1172 (F=26,0). The frequent occurrence of patulin even at refrigerated temperature indicated the importance of quality control at harvest and storage stage of fruits, to avoid constant risk of toxin ingestion.
apple; patulin; Penicillium spp.
PRODUÇÃO DE PATULINA EM MAÇÃ (Malus domestica Borkhausen), CULTIVARES GALA E FUJI INOCULADAS COM Penicillium spp.1 1 Recebido para publicação em 14/05/97. Aceito para publicação em 04/12/97.
G.U. ROSS2 1 Recebido para publicação em 14/05/97. Aceito para publicação em 04/12/97. , M.H. TANIWAKI3 1 Recebido para publicação em 14/05/97. Aceito para publicação em 04/12/97. , M. SABINO4 1 Recebido para publicação em 14/05/97. Aceito para publicação em 04/12/97. , T. VIZONI2 1 Recebido para publicação em 14/05/97. Aceito para publicação em 04/12/97. , E.Y. HIROOKA2 1 Recebido para publicação em 14/05/97. Aceito para publicação em 04/12/97.
RESUMO
A maçã (Malus domestica Borkhausen) é uma excelente fonte nutricional e de interesse econômico, sendo que a Região Sul do Brasil contribue com 90% da produção Nacional deste fruto com destaque aos cultivares Gala e Fuji. O objetivo deste estudo foi avaliar a produção de patulina nestes cultivares inoculados com Penicillium expansum NRRL 1172 e Penicillium variabile toxigênico, isolado de maçãs regionais. As frutas contaminadas foram mantidas em condições de tempo de armazenamento e temperatura que variaram respectivamente de 15 a 90 dias e de 0 a 25oC. A produção de patulina ocorreu em todas as combinações de armazenagem e temperaturas empregadas para o ensaio, independentemente dos cultivares. A produção de patulina foi negativa no 30o dia nas maçãs estocadas a 0oC inoculadas com P.expansum, mas o aumento de temperatura para 4oC restringiu a margem de segurança, causando positividade na produção da toxina para ambos os cultivares inoculados com as duas linhagens fúngicas, no mesmo período. Nas maçãs inoculadas com P. variabile ocorreu maior concentração de patulina (F=68,05) do que as contaminadas com P. expansum NRRL 1172 (F=26,0). O risco freqüente de produção de patulina nas temperaturas de refrigeração, indicaram a necessidade de melhor controle nos estágios de colheita e armazenagem de maçãs, a fim de evitar constante ingestão de toxina.
Palavras-chave: patulina, maçã, Penicillium spp.
SUMMARY
PRODUCTION OF PATULIN IN APPLES (Malus domestica Borkhausen) GALA AND FUJI CULTIVARS INOCULATED WITH Penicillium spp. The apple (Malus domestica Borkhausen) is an excellent nutritional source of economical interest, with emphasis to the Brazilian Southern Region which comprises 90% of national apple production, mainly Gala and Fuji cultivars.The aim of this research was to evaluate patulin production in both cultivars, inoculated with Penicillium expansum NRRL 1172 and a toxigenic P. variabile strain isolated from commercialized apples. Samples for analysis were taken from apples stored under combined conditions of time and temperature, which ranged from 15 to 90 days period and 0 to 25oC, respectively. Patulin was produced throughout the storage temperatures assayed with both Penicillium strains. The patulin production was negative until 30th day in apples stored at 0oC, but increase of temperature to 4oC restricted the safety threshold. P. variabile produced higher concentration of patulin in inoculated apples (F=68,05) more than P. expansum NRRL1172 (F=26,0). The frequent occurrence of patulin even at refrigerated temperature indicated the importance of quality control at harvest and storage stage of fruits, to avoid constant risk of toxin ingestion.
Key-words: apple, patulin, Penicillium spp.
1 - INTRODUÇÃO
As micotoxinas, compostos provenientes de vias metabólicas comumente presentes em fungos, proliferam em produtos agrícolas destinados à alimentação e acarretam sérios danos à saúde humana e de animais [12].
Muitos fatores biológicos contribuem para a ocorrência de micotoxinas na cadeia alimentar, com ênfase a susceptibilidade dos vegetais à infecção fúngica, assim como fatores ambientais constituídos de temperatura, umidade e danos mecânicos durante colheita e estocagem [16, 6]. Soma-se ainda os problemas oriundos de avanço tecnológico, que visando a comercialização internacional, estocam os frutos nos períodos de entressafras sob condições que permitem o desenvolvimento de fungos psicrotróficos, representados por Penicillium spp. [12].
A maçã constitue uma das frutas mais susceptíveis à contaminação por patulina, por ser um exelente substrato para Penicillium spp. [10, 13, 6]. Esta micotoxina é produzida pelos gêneros Penicillium, Byssochlamys, Paelomyces e Aspergillus, citando-se entre os produtores, P.expansum, P. patulum, P.variabile, P. citeonigrum, P. roqueforti, P. chrysogenum, P. funiculosium e P. canescens [24, 26]. Salienta-se a importância do P.expansum, em vista da predominância na estocagem de maçãs, peras, bananas, uvas e cerejas [28, 7, 20].
A presença de patulina em maçã e produtos derivados vem sendo motivo de constantes investigações, devido a freqüente contaminação natural, com relatos atingindo níveis de até 45mg/l [19, 12, 28, 20]. Estes valores descritos são alarmantes, já que a Organização Mundial de Saúde estabeleceu 50µg/l como limite máximo para suco de maçã [21, 15]. Tendências atuais sugerem redução ainda maiores neste limite, sendo que determinados países adotam níveis entre 20 e 30 µg/l, em produtos destinados à alimentação infantil [11].
Em vista da crescente produção de maçã no Brasil, principalmente dos cultivares Gala e Fuji, aliada à contribuição da Região Sul, que produz cerca de 90% da fruta [23, 1], a avaliação sobre a contaminação com patulina nos frutos comercializados torna-se um fator importante para garantir o fornecimento de frutos de qualidade à população.
O presente trabalho propõe comparar o risco da produção de patulina em maçãs (Malus domestica B.), dos cultivares Gala e Fuji, inoculadas com a linhagem de referência P. expansum NRRL 1172, em relação a linhagem de P. variabile isolada de maçãs comercializadas na Região Sul.
2 - MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 - Substrato Maçã
Três lotes, cada um constituído de 25 kg de maçã (Malus domestica Borkhausen), sendo dois lotes do cultivar Fuji e um do cultivar Gala, produzidos nos Estados do Paraná e Santa Catarina, safra de 1993/1994, foram adquiridos no CEASA (Central de Abastecimento do Paraná) de Londrina-Pr. Os cultivares Gala e Fuji foram subdivididos em sublotes de aproximadamente 3 Kg, descontaminados com solução de hipoclorito de sódio: água (1:3) e acondicionados em sacos de polietileno.
2.2 - Microrganismos
Empregou-se uma linhagem toxigênica de referência, P. expansum NRRL 1172, e uma linhagem de P. variabile, isolada de maçãs obtidas do comércio local, que produziram respectivamente 400 e 260µg/l de patulina em meio Czapek a pH 7.0.
2.3 - Padrão de Patulina
O padrão de patulina da Wako Pure Chemical Industries Ltda. foi dissolvido em clorofórmio e dividido em alíquotas de 200µl, que foram secos sob atmosfera de nitrogênio e estocadas a -20oC. Para o preparo da solução trabalho, a película foi ressuspendida em etanol e a concentração final determinada em espectrofotômetro no comprimento de onda 275 nm, segundo procedimento da AOAC [2].
2.4 - Inoculação das maçãs
As maçãs dos cultivares Gala e Fuji foram inoculadas com 104 esporos de P. expansum NRRL 1172 ou P. variabile. O inóculo foi obtido, suspendendo-se uma a três alçadas das culturas, reativadas em ágar batata dextrose à 25oC por uma semana, em tubos de ensaio contendo solução de Tween 80 a 0.1%, seguido pela contagem em câmara de Newbauer. Para a contaminação da maçã, procedeu-se assepticamente dois cortes cruzados na parte superior do fruto e introduziu-se com seringa, o volume necessário para atingir 104 propágulos.
2.5 - Efeito de temperatura e tempo de armazenagem na produção de patulina em maçã, pH e grau de deterioração
As maçãs Gala e Fuji inoculadas com P. expansum NRRL 1172 ou P. variabile foram analisadas quanto ao efeito da temperatura e tempo de armazenagem na deterioração das maçãs, produção de patulina e variação de pH. O esquema experimental consistiu de duas séries de repetições, denominadas de experimento A e B para cada cultivar. Cada experimento foi composto com cerca de 3 kg de maçã inoculadas com as espécies fúngicas, acondicionadas em sacos de polietileno e armazenadas à 0, 4 e 25oC durante 15, 30, 60 e 90 dias. Após a descrição das alterações macroscópicas nos frutos (deterioração fúngica), procedeu-se a extração de cerca de 150 ml de suco em uma centrífuga (Walita). Foi então feita a medida de pH (mod. PS15, Corning) e logo após a extração e determinação da patulina presente no extrato. Os dados referentes à concentração de patulina foram submetidos a análise estatística, a fim de avaliar a susceptibilidade dos cultivares.
2.6 - Extração e determinação da concentração da patulina
A determinação da concentração de patulina em suco de maçã foi realizada em triplicata de acordo com a técnica de cromatografia de camada delgada descrita pela AOAC, que apresenta um limite de detecção de 20 µg/l. Para a extração da patulina procedeu-se três partições, adicionando-se a 25ml de suco três partes de 25 ml de acetato de etila, sendo as fases superiores dos extratos combinadas e desidratadas com 10g de Na2SO4 anidro. Os cristais de Na2SO4 foram lavados com mais 25 ml de acetato de etila, combinado ao primeiro extrato e depois concentrado para volume inferior a 25 ml. A seguir, levado a volume de 100 ml com benzeno, procedeu-se a limpeza em coluna (10 x 500 mm) contendo 8,5 g de sílica gel 60 G, 0.63-0.020 mesh (Merck). O extrato foi eluído com cerca de 100 ml de benzeno-acetato de etila na proporção 75:25 e seco com ar comprimido. O resíduo foi redissolvido em 0.5 a 4.0 ml de clorofórmio foi aplicado em placas Kiselgel 60 G, 20x20 cm, (Merck), com padrão contendo 20µg/ml de patulina e desenvolvidas em sistema tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (5:4:1). Após o desenvolvimento das placas, estas foram reveladas com solução aquosa 0.5% de hidrocloreto 3-metil 2-benzotialinona (MBTH) e secas em estufa à 130oC por 15 minutos. Foi verificada a presença de patulina sob luz ultravioleta e a quantificação foi realizada por comparação visual com o padrão. A confirmação da patulina foi feita realizada aplicando-se novamente os extratos em três sistemas de solventes diferentes: hexano-éter anidro (1:3), clorofórmio-metanol (95:5) e clorofórmio-acetona (90:10).
2.7 - Análise estatística
Para análise estatística seguiu-se o esquema fatorial de tratamento, com delineamento inteiramente ao acaso. A diferença na concentração de patulina entre os cultivares de maçãs, efeito de tempo e temperatura de armazenagem, assim como a reprodutibilidade dos ensaios através de experimentos A e B foram comparados, empregando-se o teste F na análise de variância.
Os dados da concentração de patulina foram convertidos em escores, levando-se em consideração a variabilidade e a quantidade da toxina presente no extrato (Tabela 1).
3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os dados apresentados nas Tabelas 2 e 3 demonstraram que todas as temperaturas testadas no experimento permitiram o crescimento fúngico, assim como a produção de patulina nos cultivares Gala e Fuji inoculados com P. expansum NRRL 1172 ou P. variabile.
A temperatura de armazenagem das maçãs a 0_C permitiu o observação do crescimento macroscópico dos fungos após 30 dias apenas no cultivar Gala inoculado com P. expansum NRRL 1172. As maçãs inoculadas com P. variabile a deteriorável somente após 60 dias em ambos os cultivares (Tabela 3). Nas maçãs armazenadas a 4oC e inoculadas com P. expansum NRRL 1172, a deterioração foi observada após 30 dias de armazenagem e nas inoculadas com P. variabile a deterioração foi perceptível depois de 60 dias. A 25oC, a rapidez no desenvolvimento fúngico fez com que a deterioração fosse perceptível em todas as fases analisadas (Tabelas 2 e 3).
Estes resultados estão de acordo com os estudos anteriores realizados em meios de cultura [22], onde P. expansum NRRL 1172 apresentou atividade de crescimento ótima a 15oC, em relação a temperatura ótima de 25oC para P. variabile, indicando maior adaptação deste à condição tropical. Por outro lado, o teor nutritivo dos frutos propiciou condições adequadas para o crescimento fúngico mesmo a 0°C, o que normalmente não se observa em meios de cultura artificiais [17].
O pH em todos os experimentos não apresentou variação significante e permaneceu entre 3.9 e 4.4, independentemente do inóculo de Penicillium spp., temperatura de armazenamento, tempo de incubação e cultivares de maçã (Tabela 2 e 3). A literatura relaciona diferentes faixas de pH aliado a tratamentos térmicos em que ocorre a destruição ou redução de concentrações de patulina [18, 15], mas nosso experimento, a pequena variação de pH observada não afetou sua concentração.
Na temperatura de 0oC,não houve produção de patulina em ambos os cultivares de maçã, inoculados com as duas espécies fúngicas, até o 30 dia de armazenagem. Entretanto, concentração de patulina acima do nível permitido pela Organização Mundial de Saúde (OMS) foi detectada no 60o dia nas mesmas condiçõers (tabela 2 e 3). Nesta temperatura atingiu-se nível máximo de 2133µg/l no cultivar Gala inoculado com P. variabile, após 90 dias de armazenagem (Tabela 3). O pequeno aumento na temperatura para 4oC reduziu a margem de segurança, aumentando a produção de toxina, pois as duas linhagens fúngicas produziram concentrações elevadas, atingindo níveis de 6.400µg/l de patulina, nos dois cultivares de maçãs estudados.
A Tabela 4 analisa a significância estatística da produção de patulina nos experimentos realizados, permitindo melhor interpretação dos parâmetros estudados. A tabela acima mostra os resultados do teste F na análise de variância para produção de patulina, destacando que houve diferença significativa com relação ao fator tempo e temperatura, para as duas linhagens fúngicas (p=0.0001). Segundo a análise estatística, os parâmetros tempo e temperatura de armazenagem tiveram maior influência na produção de patulina por P.variabile (F=68,05), do que por P. expansum NRRL1172 (F=26,0). Maior concentração de patulina foi detectada na temperatura de 4oC, cuja produção aumentou no decorrer de 90 dias (Tabela 2 e 3). Salienta-se que esta temperatura é comumente utilizada para manter frutas em refrigerador doméstico, daí a importância no controle de qualidade das frutas comercializadas. Portanto, a produção de concentrações variando de 187µg/l a 400µg/l (Tabelas 2 e 3) de patulina, em um mês de estocagem deve ser considerada preocupante, já que o limite máximo permitido pela Organização Mundial de Saúde para suco de maçã é de 50µg/l [21, 9].
De modo geral, as maçãs inoculadas com P. variabile apresentaram maior concentração de patulina do que aquelas inoculadas com a linhagem de referência (p=0.0001). Como a maçã é uma fruta muito consumida, com relevante potencial econômico, o controle no desenvolvimento de fungos toxigênicos é de extrema importância a fim de evitar-se constante ingestão de patulina [8]. A toxina poderá ocorrer em frutos com pequena lesão, consideradas visualmente sadias para os consumidores . Neste sentido, os resultados mostraram que a integridade da superfície do fruto é essencial para garantir maior tempo de armazenagem. Aliado a isto, condições ambientais que permitem o crescimento fúngico, assim como a produção de toxinas, são os principais fatores capazes de influir na sanidade dos frutos e produtos derivados [28].
Embora as características físico-químicas referente à composição de maçã variem dependendo do cultivar, fertilidade do solo e condições climáticas [3, 4], não houve diferença significativa na susceptibilidade dos cultivares analisados, quanto a maior produção de patulina. Conseqüentemente, a tabela 4 mostra que, tanto o cultivar Gala ou Fuji são susceptíveis à produção de patulina por P. expansum NRRL 1172 (F=0.25) ou P. variabile (F=7.0), independentemente da composição orgânica ou iônica (dados não apresentados).
Analisando-se a reprodutibilidade entre os ensaios, baseados na comparação dos experimentos A e B os cultivares de maçãs, a análise estatística mostrou coerência nos resultados obtidos, com valor de F=0.25 para P. expansum e F=7.0 para P. variabile.
Na temperatura de 25oC, após 30 dias de armazenagem, detectou-se uma produção de patulina de 2400µg/l para o cultivar Fuji inoculado com P. expansum NRRL 1172 (Tabela 2) ou P. variabile (Tabela 3). No cultivar Gala sob as mesmas condições detectou-se respectivamente 325 e 400µg/l de patulina. Isto indica que provavelmente o pico máximo de produção esteja entre 30 a 60 dias de armazenagem, onde não se procedeu análise de toxina. Salienta-se que a concentração de patulina em todas as maçãs inoculadas atingiu nível não detectável no 90o dia de incubação.
Este fator interessante observado no ensaio a 25oC, que consistiu na redução da concentração de patulina, à medida que se intensificou a deterioração das frutas (Tabela 2 e 3), tem sido relatado também por STINSON et al. (1978) e BRACKETT & MARTH (1979) [25, 5]. A redução marcante na concentração da toxina coincidiu com o desenvolvimento progressivo de leveduras, que gradativamente substituíram os fungos filamentosos (dados não apresentados). A literatura descreve processos de detoxicação, resultante do metabolismo de outros microrganismos, sejam bactérias, protozoários ou fungos, incluindo as leveduras [25]. Embora se desconheça leveduras toxigênicas [14], já é de conhecimento a sua capacidade produtora do fator "killer" [24], um grupo de compostos com característica peptídica e inibitória a outras leveduras. Recentemente, WALKER et al. [29], observaram um efeito antagônico bastante interessante de fator "killer" sobre outros grupos microbianos, incluindo fungos filamentosos. Provavelmente, o efeito antagônico aliado à atividade de degradação, resultaram na substuição da microbiota e detoxicação da patulina nas maçãs inoculadas com Penicillium spp.
4 - CONCLUSÕES
Em suma, em condições normais de armazenagem, incluindo temperaturas de refrigeração, Penicillium spp. toxigênico tanto da linhagem de referência ou a linhagem isolada local, podem produzir patulina. O risco da ingestão de toxina torna-se ainda maior em vista da impossibilidade de manutenção das maçãs sob baixas temperaturas em mercados abertos, aliado à freqüente comercialização de frutos com lesões aparentes. O crescimento a 0°C mostra que a maçã apresenta condição nutricional excelente, capaz de diversificar o metabolismo secundário fúngico para a produção de patulina.
5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Datas de Publicação
-
Publicação nesta coleção
05 Out 2001 -
Data do Fascículo
Abr 1998
Histórico
-
Recebido
14 Maio 1997 -
Aceito
04 Dez 1997
